酶联免疫吸附法检测HBsAg结果的影响因素探讨

王一丁

（遂宁市中医院检验科，四川遂宁629000）

酶联免疫吸附法检测HBsAg结果的影响因素探讨

王一丁

（遂宁市中医院检验科，四川遂宁629000）

目的探讨不同因素对酶联免疫吸附法检测HBsAg结果的影响。方法采用同一批次的试剂对不同状态的血清标本进行同步检测，对结果进行比较分析。结果A组(不抗凝血液标本)HBsAg阳性检出率分别为44.4%、11.1%和0%。B组(抗凝剂血液标本)HBsAg阳性检出率分别为0%、33.3%和0%。C组(含血细胞标本)HBsAg阳性检出率分别为22.2%、66.7%和100%。结论引起结果有误的原因有外源性和内源性，其中最主要的是标本有溶血或者浑浊现象。为了最大限度地减少误差的发生，要对血清标本的不同情况采取相应的处理。

酶联免疫吸附测试；乙型肝炎表面抗原；影响因素

乙型肝炎表面抗原（HBsAg）是病毒HBV在肝细胞内表达的产物，也是人体感染乙肝病毒后首先出现的血清标志物[1]。HBsAg阳性可见于急性乙型肝炎患者潜伏期、急性感染期、慢性乙型肝炎、无症状HBsAgHBV携带者。因此HBsAg是乙型肝炎的主要感染指标之一。在临床上，酶联免疫吸附法（ELISA）因其灵敏度高、特异性强等优点而在HBsAg检测中被广泛应用。但是实际上在用此法检测HBsAg时常常会出现假阳性、假阴性及重复性不好的现象[2]。尤其是假阳性检查结果往往会给体检人群带来巨大的思想负担，容易引发对医疗人员的投诉，造成不必要的麻烦[3]。针对此类现象，笔者现采用同一批次试剂对不同的血清标本进行重复检测，以分析影响HBsAg检测结果的因素，使其假阳性率更低，结果更加准确，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 一般材料选取我院2010年7月至2011年7月27例体检人群做乙肝两对半的静脉血血清标本81份。采用上海科华生物工程股份有限公司生产的乙肝酶联免疫HBsAg诊断酶联免疫试剂盒及Anthos1010酶标仪和Anthos Fluido洗板机。

1.2 方法分组与检测方法严格按照试剂和仪器说明书里的内容操作。在吸取血清的过程中要小心，避免人为破坏性因素[4]。将27例健康人血液标本分别取3管，平均分为A、B、C 3组，共81份标本。A组27份为不抗凝血液标本，分为3小组，每组9例，分别静置0.5 h、1 h和2 h后，静置后离心15 min，取出血清分别检测HBsAg。B组27份为加抗凝剂血液标本，平均分为3组，每组各9例，分别装入不抗凝管、肝素钠抗凝管和枸橼酸那钠抗凝管，其中不抗凝管静置2 h后离心，再静置15 min。C组27份为含血细胞标本，抽取其中健康人血液标本，取0.2 ml血细胞和1.2 ml血清稀释成含有不同浓度血细胞的标本，检测HBsAg含量。

2 结果

2.1 A组A组不抗凝标本中，凝血0.5 h、1 h、2 h的HBsAg阳性检出率分别为44.4%(4/9)、11.1%（1/9）和0（0/9）。

2.2 B组B组分别装入不抗凝管、肝素钠抗凝管和枸橼酸那钠抗凝管的HBsAg阳性检出率分别为0%(0/9)、33.3%（3/9）和0%(0/9)。

2.3 C组C组中随着血细胞浓度的增高，HBsAg阳性检出率也随之增高，分别为22.2%（2/9）、66.7%（6/9）和100%（9/9）。

3 讨论

体检时，血液中心和血站对供血者健康检查中要求HBsAg为阴性，因此HBsAg的结果是否准确有着至关重要的意义。最常用的ELISA标本是血清，而血浆和血清的不同之处在于前者含有纤维蛋白原和抗凝剂，一般检验中均以血清作为检测的标本。ELISA一步法检测乙肝两对半可以使操作步骤简化，缩短检验时间，同时应用高亲和力的单克隆抗体或者高纯度的抗原可以显著提高检测的特异性和敏感性[5]。

3.1 结果分析本研究中A组为不抗凝血液标本组，结果显示，在血液自我凝固时间为0.5 h和1 h就强行分离血清检测HbsAg的假阳性率为44.4%和11.1%。有时候体检人员为了节省时间快速检测，经常会在血液还没有开始凝固的时候就强行分离血清，这样很容易造成假阳性的结果误导。若体检者在次日复查同一指标，完全可以因为血液已经完全凝固，血清中不含有纤维蛋白原而检测出阴性的结果。而血清分离不彻底的原因还会有以下一些情况：1）血清中残留有部分纤维蛋白原，容易附着在反应孔壁或者在气孔凝集，两种情况都可以将酶结合物吸附在反应孔中无法洗涤干净，因而产生假阳性结果[6]。2）纤维蛋白原反应的微环境发生改变，会降低检验的灵敏度，从而产生假阴性。B组为加入抗凝剂的标本，结果显示，肝素钠抗凝管中HBsAg出现33.3%的假阳性后果，可能原因是由于各种人为因素引起标本溶血，使红细胞产生溶解，细胞内的过氧化物酶进入血浆，并大量吸附于细胞碎片及纤维蛋白原上，增加了加样后微孔的洗涤难度，同时抗凝剂在抗凝过程中合成了结合物，使ELISA系统中的过氧化物酶显色出现异常，使结果不一致[7]。因此在工作人员采血时系带时间不要过久，抽血时放慢速度，同时保存处理好标本，防止溶血。C组为含有血细胞的标本。大多情况下血清为带血细胞标本，而其中红细胞里的亚铁血红素具有过氧化物酶的活性，如果反应孔因为非特异性吸附红细胞，加入底物后产生显色反应，就会产生假阳性后结果。随着血细胞浓度的升高，假阳性的比例也在上升。

3.2 试剂的选择随着科学技术的不断发展，肝炎标志物的检验方法也在不断更新提高。各生产厂家生产的酶联免疫吸附试剂盒在很大程度上方便了基层单位开展日常工作。然而，即使是同一试剂盒，不同厂家生产的试剂灵敏度与特异性均存在一定差别。有的厂家酶标板孔间A值差甚至大于15%，标记酶的活性及显色液的稳定性不好。使用劣质试剂必然使结果的错误率上升。因此应该选择高质量的试剂盒，从外源性因素上最大程度地降低错误率[8]。

3.3 标本因素的影响标本污染：标本受到细菌的污染，菌体内可能含有辣根过氧化物酶，容易产生非特异性显色，出现假阳性；标本放置时间过久：在冰箱中存放过久的标本，其血清IgG可聚合为多聚体，甲胎蛋白可以形成二聚体，在ELISA测定中会造成假阳性[9]。若采血后不在当天检测，标本应放在2℃～8℃的冰箱里保存。标本若需储存较长时间，则应吸出血清放在-20℃的冰箱内保存[10]。

3.4 操作因素工作人员在加样时应使用一次性吸嘴，避免交叉污染。加样品、酶结合物和底物时都应该将所加物质加在ELISA板孔的底部，不应加在孔壁上部，而且要注意不可以溅出和产生气泡，否则也会影响结果的准确性[11]。在人工操作时，加样板过多会造成加样后放入孵箱前等待时间过久，或孵育时没有加盖，使标本蒸发吸附在孔壁上，或者人为延长孵育时间，使非特异性结合紧附在反应孔周围不好易彻底清洗干净，造成假阳性。所以在加样后要及时放入孵箱，标本数量过多时要分批操作并加盖，严格按照说明书控制操作时间，最大限度减少假阳性的发生。

3.5 洗涤洗涤在此法中虽不是一个反应步骤，但却对试验的成功与否至关重要。洗涤时为了洗去反应液中没有与固态抗原抗体结合的物质以及反应过程中非特异性吸附于固体载体的干扰物。洗涤时的水切勿重复反复利用，避免交叉感染现象的发生。要将留在孔中的残余酶标记物和血液成分等彻底清洗干净，避免因清洗不彻底产生误差[12]。

4 总结

通过以上分析，我们认为在HBsAg检测过程中注意以下几点可减少假阳性的发生：1）当天气寒冷时，应将血液标本应置于浮箱内孵育足够的时间，待血液标本完全凝固后分离血清；临床采集的血液标本不要进行强制分离，建议工作人员将采集的标本置于37℃孵箱内保存1～2 h[13]。2）要严格避免标本出现溶血现象，血红蛋白中含有亚铁血红素，有类似过氧化物酶的作用活性类似于过氧化物，因此在以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，如果血清红蛋白的浓度过高，很容易在温育的过程中吸附在ELISA包板聚乙稀板孔，与加入的辣根过氧化物酶底物产生显色反应，因此在采集标本中要尽量避免溶血。3）血清不能用于肝素钠抗凝，因为肝素钠在ELISA测定中会抑制酶的活性[14]。

综上所述，影响HBsAg检测结果的因素有很多。为了避免检测结果出现呈假阳性而误导工作人员和体检人员，要求检验人员从多方面严格控制质量，以期达到最大限度地降低假阳性率。

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[14]刘思寨.ELISA法检测HBsAg影响因素的探讨[J].现代预防医学,2004,6：882.

Influencing factors of the detection of HBsAg by ELISA.

WANG Yi-ding.Department of Clinical Laboratory, Suining Municipal Hospital of TCM,Suining 629000,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo explore the impact of different factors on the detection of HBsAg by Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).MethodsSerum samples of different status were detected synchronously by the same batch of reagents through ELISA.The results were analyzed.ResultsThe positive rate pf HBsAg was 44.4%、11.1%and 0%in group A(blood samples without anticoagulation),0%,33.3% and 0%in group B(blood samples with anticoagulation),22.2%,66.7%and 100%in group C(blood cell samples).ConclusionInaccurate detection results were tend to be caused by exogenous and endogenous factors,mainly hemolysis or turbidity in the specimen.In order to minimize the occurrence of error,appropriate measures should be taken to treat the serum samples according to the individual status of the serum sample.

Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA);HBsAg;Influencing factor

R446.61

B

1003—6350（2012）24—103—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.24.044

2012-10-29）

王一丁（1959—），男，四川省遂宁市人，副主任技师，本科。