均匀设计法优化刺梨多糖的提取工艺

王 慧，黄 聪，杜 薇

(1.中国人民解放军第四十四医院药剂科，贵州 贵阳 550009；2.贵阳中医学院药理教研室，贵州 贵阳 550002；3.贵阳中医学院药学系，贵州 贵阳 550002)

刺梨RosaroxburghiiTratt.f.normalisRehd.etWils为蔷薇科植物，产于云贵山区及江浙丘陵地带，尤其在贵州山区更为广见，过去民间以果实和根入药，用于消食健脾、收敛止泻与解毒[1]。近代研究证明，刺梨汁富含的维生素C、维生素E及超氧化物歧化酶、刺梨多糖和多种微量元素等，具有消除自由基、降低脂质过氧化损伤、提高免疫功能等作用[2]。目前对刺梨多糖提取工艺的研究未见报道，本课题中使用均匀设计法对刺梨多糖的提取条件进行探讨，确定了其最佳提取工艺，为深入进行多糖的纯化、结构分析、药理活性等研究奠定了基础，同时为临床的应用提供依据，现报道如下。

1 仪器与试药

DU－70型紫外－可见分光光度计(美国贝克曼公司)。刺梨果实采自贵州贵阳、高坡、青岩、贞丰、龙里、凯里、关岭孟关等地，经贵阳中医学院董立莎教授鉴定为刺梨 Rosroxburghii Tratt.f.normalis Rehd.etWils的果实；浓硫酸、苯酚(重蒸)、葡萄糖等均为分析纯，水为蒸馏水；苯酚试剂(取苯酚500g，加铝片0.5g与碳酸氢钠0.25g，蒸馏收集180℃馏分，称取此馏分34g，加水500g置棕色瓶中，备用)。

2 方法与结果

2.1 刺梨多糖含量测定

2.1.1 溶液制备

精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖0.2021g，置250mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.8084g/L葡萄糖溶液，精密吸取溶液7.00mL，用水定容至100mL，得56.59μg/mL的葡萄糖对照品溶液。精密称取过40目筛的刺梨粗粉0.2g，各3份，置索氏提取器中，经100mL石油醚(60～90℃)回流提取至无色，药渣挥干后，再将药渣用100mL 85%乙醇(90℃)回流提取2 h，以除尽单糖及醇溶性杂质，药渣挥干，置圆底烧瓶中，按均匀试验所得最佳提取条件，即加水25mL，提取3次，每次1 h，合并3次滤液，定容至250mL容量瓶中，即为供试品溶液。

2.1.2 最大吸收波长选择

精密量取对照品溶液，补蒸馏水至2.0mL，按正交试验得出的最优显色条件，在200～600 nm波长范围内做全波长扫描，确定最大吸收波长为491 nm。

2.1.3 方法学考察

标准曲线制备：精密量取56.59μg/mL葡萄糖对照品溶液0.40，0.60，0.90，1.20，1.50，1.80，2.00mL，分别置25mL比色管中，依次加水使最终体积为2.00mL，摇匀，加5%苯酚溶液1mL，浓硫酸5mL，置40℃温水浴中放置15min，取出放冷，测定其吸光度，以吸光度(A)为纵坐标、质量浓度(C)为横坐标绘制工作曲线，得回归方程 A=0.059 1C－0.028 7，r=0.999 3(n=7)。结果表明，多糖质量浓度在2.830～14.150μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。

精密度试验：精密吸取质量浓度为56.59μg/mL的对照品溶液1.30mL 5份，按标准曲线制备项下操作，测定吸光值。结果的 RSD值为1.30%(n=5)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取供试品溶液，按标准曲线制备项下操作，每隔0.5 h，测定1次吸光度，共测定5次。结果的 RSD为1.51%(n=5)，表明供试品溶液在3 h内较稳定。

重复性试验：精密称取同一样品5份，每份0.2g，依法制备供试品溶液并测定。结果的 RSD为2.97%(n=5)。

加样回收试验：精密称取同一样品5份，每份约0.1g，分别精密加入一定量的葡萄糖对照品，按供试品液溶的制备方法制备溶液，依法测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 多糖加样回收试验结果(n=6)

2.1.4 换算因子确定

精密称定刺梨多糖16.00mg，置100mL容量瓶中，以蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀作为贮备液。精密吸取贮备液0.7mL，按标准曲线制备项下方法操作，测定吸光度 A，从回归方程中求出供试品溶液中葡萄糖的质量浓度，按下式计算换算因子，f=w/(c×d)，测得 f值为2.089 2，式中 w为多糖质量(mg)，c为多糖稀释液中葡萄糖质量浓度(g/L)，d为多糖稀释因素，f为换算因子。

2.1.5 样品含量测定

精密吸取供试品溶液2.00mL，置试管中，按标准曲线制备项下方法操作，测得 A值，从回归方程中求出供试品溶液中葡萄糖含量，按下式计算样品中多糖含量。多糖含量(%)=(c×d×f)/ w×100%，式中，C为供试液中葡萄糖质量浓度(g/L)，d为供试液中稀释因素，f为换算因子，w为供试品质量(mg)。结果见表2。

表2 不同产地刺梨多糖含量测定结果(n=3)

2.2 均匀试验

2.2.1 试验设计

根据文献[3－4]及预试验结果，考察的因素与水平确定为溶剂量(因素A)、提取时间(因素B)、提取次数(因素C)、提取温度(因素D)及醇沉浓度(因素E)，见表3。采用U6(65)均匀设计，以刺梨多糖提取率作为评价指标，筛选刺梨多糖回流提取的最佳条件，均匀试验设计见表3。随机安排试验，精密称取过40目筛的刺梨粗粉10g，6份，置索氏提取器中，经100mL石油醚(60～90℃)回流提取脱脂，药渣挥干后，再将药渣用100 mL 85%乙醇(90℃)回流提取2 h，以除尽单糖及醇溶性杂质，药渣挥干溶剂后，按均匀设计方案，确定加蒸馏水、提取时间、提取次数、提取温度，合并提取液。减压浓缩至一半，经明胶除鞣质，用氯仿和正丁醇(3∶1)多次萃取，除去蛋白质，加1%的活性炭脱色2次，抽滤，滤液加入无水乙醇使乙醇含量达到试验设计所需的量，冰箱静置24 h。过滤，残渣先后用无水乙醇、丙酮、乙醚多次洗涤60℃烘干，即得较纯的刺梨多糖。精密称取刺梨多糖32.30mg，按标准曲线项下操作，测定吸光度，并计算多糖得率。结果见表3。

表3 U6(65)均匀试验设计表

2.2.2 数据处理与结果分析

将数据用SPSS 11.0软件进行多元回归分析处理，得回归方程Y=9.429－0.017A－0.283B+0.378C，其中 S=0.022 7，r=0.999 00，F=492.581，F＞Fɑ，Y的理论预测估计值为 Y= 8.476 7±0.390 8，即 Y值在(7.871 7～9.081 7)%范围内，检验通过，回归方程有意义。回归方程及方差分析表明，影响提取效果的因素顺序为C＞A＞B，即提取次数、溶剂用量、提取时间，提取温度和醇沉浓度几乎没有影响，由直观分析可知，最佳工艺为A1B1C3，即溶剂(水)用量为50倍，提取时间为1 h，提取次数为3次。从试验的经济条件考虑，提取温度为80℃，醇沉浓度为80%。因此，刺梨多糖的最佳提取条件为A1B1C3D1E1。

2.2.3 验证试验

根据优选出的最佳提取条件提取刺梨多糖，平行试验3份，按标准曲线制备项下操作，测定吸光度，并计算多糖得率为8.48%，RSD为1.60%。试验验证结果与预测结果基本接近，表明该提取条件稳定、可行。

3 讨论

本试验中采用硫酸－苯酚法测定刺梨多糖的含量，使刺梨多糖在硫酸作用下先水解成单糖，并迅速脱水，生成糖醛化合物，然后与苯酚合成有色化合物，在491 nm波长处测定吸光度，计算含量。

按均匀设计安排试验条件，明显减少了多因素试验的试验次数。对于刺梨多糖的提取，影响因素最大的是提取次数，其次是溶剂用量、提取时间，提取温度和醇沉浓度几乎没有影响。均匀设计试验验证结果与预测结果基本接近，表明该提取条件稳定、可行。

从含量测定结果可看出，不同产地样品中刺梨多糖的含量不同，其中关岭刺梨多糖含量最高，即24.96%。

[1]赵学敏[清].本草纲目拾遗[M].北京：人民卫生出版社，1983：295.

[2]陈执中，陈务本.民间药刺梨及其制剂的药效研究和临床应用[J].中国民族民间医药杂志，1994(8)：20.

[3]董钰明，唐兴文，张树江，等.红毛五加多糖的含量测定条件和提取工艺优选[J].中南药学，2006，4(2)：86－88.

[4]杜清等.明党参多糖提取工艺研究[J].现代中药研究与实践，2005，19(4)：51.