现代生物技术在我国萝卜遗传育种中的应用与展望

熊秋芳，张小康，汪志红，周国林，李世升

（武汉市蔬菜科学研究所，430345）

萝卜（Raphanus sativusL.）为十字花科萝卜属一年或二年生雄雌同花的异花授粉作物，在我国栽培历史悠久。萝卜杂种优势十分明显，目前主要利用雄性不育系进行制种。现代萝卜育种所要改良的目标性状也在不断的变化，除了对丰产、优质、抗病的要求越来越具体以外，又提出一些新的目标，如耐热、耐抽薹、早熟、晚熟、品质优、口感佳。

常规育种方法在生产上应用广泛，技术容易掌握，具有不可低估的潜力，但也往往具有局限性，如育种年限长。现代生物技术是细胞生物学与分子生物学理论指导下发展起来的一种高新技术，从20世纪70年代开始发展，给动植物品种改良带来了一场革命。包括基因工程技术、小孢子培养技术、原生质体融合技术、诱变技术在内的现代生物技术大大加快了蔬菜遗传改良的步伐，把育种技术从宏观水平提高到微观水平。现对现代生物技术在我国萝卜遗传育种中的应用加以综述，并对萝卜育种中还未涉及到的技术加以展望，以期为萝卜遗传育种及资源创新提供新的思路。

1 小孢子培养技术与萝卜遗传育种

1.1 小孢子培养技术

小孢子是指未成熟的单核花粉细胞。小孢子培养技术是将小孢子从花药中分离出来，以单个小孢子作为外植体进行培养，促进其细胞分裂和单倍体胚，进而诱导发育成单倍体植株的过程。实践证明，经小孢子培养得到的双单倍体或DH系株系间的性状变异幅度大，超亲现象和出现特殊优良性状的频率显著高于常规育种，株系内性状整齐，世代间稳定性强。通过小孢子培养出来的自交系具有高度的纯合性，以此配制的杂交组合往往具有更强的杂种优势。另外小孢子培养所得的胚状体可以作为理想的转基因受体，用于植物基因工程外源基因导入。

1.2 萝卜小孢子培养

萝卜小孢子培养始于20世纪80年代，Liehter[1]首次报道了萝卜游离小孢子培养成功诱导出胚状体。Takahata等[2]对11份萝卜材料进行了培养，其中有6份获得了胚状体，部分获得了再生植株。张丽[3]以20个不同类型的萝卜品种为材料，应用大量元素减半的1/2 NLN液体培养基进行小孢子培养，其中1份材料获了胚状体。付传翠等[4]认为萝卜中普遍存在基因型偏性问题，在预处理过程中保存较高活力是小孢子诱导成功的关键。陈文辉等[5]对30份夏秋萝卜进行培养，有4份秋萝卜材料获得胚状体，认为基因型与诱导率有很大的相关性，低温预处理花蕾可以显著提高出胚率，33℃高温热激处理48 h是改变小孢子发育途径的重要条件。周志国等[6]以萝卜游离小孢子再生植株为试验材料，采用形态学观察、根尖染色体鉴定、流式细胞测定等方法进行了倍性检测。结果表明，由游离小孢子培养获得的植株中同时含有单倍体、双单倍体和多倍体，来源不同的小孢子培养获得的植株倍性比例不同，不同倍性植株具有不同的形态特征。熊秋芳[7]在1/2 NLN-12培养基中，游离小孢子培养20～25 d后，20个基因型中有8个获得了胚状体，占供试材料的40%。对千禧二号萝卜双单倍体植株进行亲和指数的测定，结果显示双单倍体植株蕾期亲和指数均大于5，花期亲和指数均小于0.3，符合自交不亲和系的标准，可以作为亲本配制杂交组合。

2 原生质体融合技术与萝卜遗传育种

2.1 原生质体融合技术

原生质体融合，亦称细胞融合、体细胞杂交、超性杂交或超性融合，是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程。原生质体融合可避免受精作用中的种的特异性配子识别反应，有可能打破远缘杂交中的有性不亲和界限。原生质体技术还可用于种质资源的保存、细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入等方面。自从1960年Cocking首次用纤维素酶制备番茄根原生质体获得成功后，迄今已有46个科160多个属360多种植物的原生质体再生植株问世，80多种科间、属间、种间或品种间细胞融合获得胞质种。近年来，人们将原生质体技术广泛应用于蔬菜育种工作中，并取得了令人瞩目的成果，获得了甘蓝和白菜、番茄、油菜、萝卜等体细胞杂交植株[8]。

2.2 萝卜原生质体融合

原生质体融合是将两种异源原生质体，在诱导剂的诱发下相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合，再经过细胞壁再生形成杂种细胞的过程。雷开荣等[9]以甘蓝生产种为受体，以高抗黑腐病、软腐病及根肿病的萝卜野生材料为供体，在原生质体融合前，用酶或酶+紫外线对供体原生质体进行单因素或双因素复合处理，以探讨不同处理方法对植株再生的影响。结果表明，对供体亲本进行双因素复合处理，实现了原生质体非对称性融合并获得再生植株。孙振久[10]先后探讨了不同电融合条件、融合液、原生质体密度及不同品种对甘蓝和萝卜原生质体融合及细胞分裂的影响，为萝卜原生质体融合技术的应用奠定了很好的基础，是成功获得杂种再生植株的前提。

远缘杂交可以有效地进行异种、属间遗传物质的相互引入和转移，有目的地进行作物性状改良，在作物育种上具有广泛应用。萝卜具有优良的抗线虫病基因和细胞质雄性不育基因，若通过远缘杂交的方法将萝卜的优良基因导入其他作物中，无疑对当前作物育种具有重要的意义，同样我们也可以将别的作物的优良基因导入萝卜中来。人们已获得了萝卜芸薹、萝卜甘蓝、萝卜黑芥等新品种[11]，但成功率不高。胡大有等[12]2004年利用3个甘蓝型油菜品种和1个黑芥品种与日本樱岛大根萝卜进行正反交，以研究远缘杂交的亲和性，试验结果表明，萝卜与油菜的远缘杂交存在严重的生殖障碍。甘彩霞等[13]将萝卜与大头菜，张凤银等[14]将萝卜与小白菜进行属间杂交，其后代具体表现为荚果长到一定程度后黄化，杂种胚胎开始败育。如果采用原生质体融合技术则在一定程度上可克服杂交育种中诸如不亲和性、性器官败育障碍等问题。

3 诱变育种技术与萝卜遗传育种

3.1 诱变育种技术

诱变育种技术是人为利用物理或化学因素来处理种子、植株、组织、细胞或花粉，使其基因型产生遗传变异，从中选择培育新品种的方法。在众多育种技术中，诱变育种因其突变频率较高、突变谱较宽、能有效创造新类型种质资源，且突变性状稳定较快，有利于加速新品种选育进程等优势，在作物育种中得到广泛应用，并且取得了极大成功；同时通过诱变技术获得的一系列新颖突变种质资源也是进行功能基因研究的重要基础材料。

诱变育种技术包括辐射诱变、化学诱变和航天诱变3种。辐射诱变是指人为地利用物理诱变源，如离子束、γ射线、β射线、χ射线、中子等高能射线诱发作物产生突变，通过突变体的选择和鉴定，直接或间接地育成可供生产利用的新品种。化学诱变是用化学诱变剂如甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES）等烷化剂或碱基类似物等处理植物材料，通过与核苷酸中的磷酸、嘌呤、嘧啶等分子直接反应来诱发突变，从而引起植株形态特征的变异。航天诱变又称空间诱变，是将供试诱变材料搭乘返回式卫星或宇宙飞船，送到距地球200～400 km的太空，利用空间宇宙射线的强辐射，在高真空、微重力和交变磁场等特殊环境中进行诱变处理，使供试材料产生有利变异，返回地面试种后继续采用常规育种技术，从中选育出农作物新品种。航天诱变可以使作物本身染色体产生缺失、重复、易位、倒置等基因突变。

3.2 萝卜诱变育种

诱变实际上是一个“无中生有”的技术，它在创造或改变单基因控制的特殊性状方面具有独特的优势。蔬菜诱变育种始于20世纪50年代，70年代后期，随着诱变育种技术与方法日趋成熟，育成的作物品种逐渐增多。近年来，我国科技工作者通过诱变技术已先后育成番茄、辣椒、甜瓜和黄瓜等蔬菜新品种。同属十字花科的油菜诱变育种成绩显著，单采用60Co-γ射线处理干种子，先后育成了沪油 4号、111、73-103、秀油 1号，甘油 5号等新品种[15]。石淑稳等[16]用EMS处理甘蓝型油菜小孢子再生的胚性培养物，获得长角果和矮秆突变体。甘蓝型油菜皖油518接受空间诱变后，回收种子SP2代表现出丰富的遗传变异，其中包括早熟、长角、多分枝、矮化、黄籽等突变类型。另外，SP2代各株系间产量亦表现出明显差异，为培育高产油菜新品种创造了丰富的遗传资源。萝卜诱变育种在我国起步较晚，目前只有少量资源经卫星搭载，如苏州地方萝卜良种梅李60天经神州一号搭载，返回地面后经多代系统选育，具备了产量高、品质好、生长速度快、抗病性强的特点。梁秋霞等[17]选取樱桃萝卜点点红为材料，用低能Ar+注入其干种子后的生物学效应进行了研究，结果表明不同剂量的低能Ar+注入都会使种子发芽率、成活率及不同阶段的生长和发育产生变异。可以预见，萝卜诱变育种具有广阔的前景。

4 分子标记技术与萝卜遗传育种

4.1 分子标记技术

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。

4.2 分子标记技术在萝卜中的应用

据 Vavilov 1923-1931年、Darling-ton 1945年和1955年的调查认为，萝卜起源于中亚西亚和中国[18]，世界各地均有种植，欧美主要栽种小型四季萝卜，亚洲以大型萝卜为主。中国栽培萝卜历史悠久，萝卜种质资源十分丰富，我国现已收集保存的萝卜资源有2 071份，研究这些资源的遗传背景和关系是有效利用资源的前提[11]。

分子标记在萝卜种质资源遗传多样性分析以及标记辅助选择等方面得到应用。孔秋生等[19]用RAPD标记对收集保存的来源于不同国家和地区的代表性栽培萝卜种质资源的遗传多样性进行探讨性分析，认识其遗传亲缘关系，为大批量萝卜种质资源的鉴定和分类以及资源的有效利用提供理论依据和技术指导。汪志伟等[20]以萝卜恢复系和不育系配制杂交组合，并以174株个体组成的F2代分离群体作为恢复基因的标记群体。以分离群体的不育株和可育株分别建立不育池和恢复池，利用100个RAPD引物对两池间的多态性进行研究。结果显示，标记OPC6 1900与萝卜细胞质雄性不育恢复基因连锁，可用于对育性恢复基因的标记辅助选择。赵丽萍等[21]应用SRAP与AFLP两种分子标记技术进行了萝卜品种鉴定分析。龚义勤等[22]、宋贤勇等[23]、武创等[24]对萝卜基因组 DNA的 RAMPPCR分析体系进行优化，并初步将体系应用于萝卜品种遗传多样性和种质鉴定分析，为萝卜种质资源晚抽薹、CMS恢复基因、肉质根形成等重要性状标记与分子育种提供重要技术基础。徐文玲等[25]采用AFLP结合银染检测技术，对与萝卜耐抽薹基因连锁的AFLP标记进行了筛选，结果以EcoRI-ACT/MseI-CTG和EcoRI-ACG/MseI-CAG两对引物组合在抗感池中分别筛选出175 bp和123 bp的两个标记CTG180和CAG120。谭婷婷等[26]利用萝卜包含ORF138基因片段的Ogura胞质雄性不育（CMS）分子标记对收集的5份萝卜雄性不育系种子材料进行鉴定，结果表明有1份种质为Ogura雄性不育材料，将Ogura分子标记应用于萝卜Ogura细胞质雄性不育基因的转育工作中，可以提高选择效率，缩短育种年限。张庶等[27]利用cDNA-AFLP技术研究了莲座期的福山包头大白菜、翘头青萝卜及其杂种F1代的叶片，获得特异表达的转录片段（TDF），从而为深入研究大白菜杂种优势相关基因和萝卜-大白菜基因组互作奠定了基础。

5 基因工程技术与萝卜遗传育种

5.1 基因工程技术

基因工程技术是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成基因工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。运用基因工程技术，可以改良植物品质，进行植物抗虫、抗病、抗寒、抗旱、抗除草剂的研究。

荆赞革等[28]根据GenBank中扩展蛋白序列设计特异引物，从萝卜高代自交系NAU-LVYH06中克隆到一个扩展蛋白基因 RsEXPB1（GenBank accession No.GQ387363，GQ387364），该基因主要在萝卜生育前期的幼叶、肉质根木质部和韧皮部中表达，且表达丰度可能与该部位细胞生长分裂状态相关。潘大云等[29]报道了将萝卜抗线虫基因导入油菜的研究结果。邓晓东等[30]进行了萝卜抗真菌蛋白基因Rs-AFPs转化番茄的研究。李文君等[31]发表了萝卜叶绿体ATP酶β亚基的cDNA克隆及序列特征的研究结果。王玲平等[32]以萝卜品种圆白为材料，根据白菜CYP450基因CYP86MF保守序列设计引物，利用RT-PCR和5'/3'RACE相结合的方法克隆了一个CYP450基因的cDNA全长序列，并对它进行了序列分析，为CYP450基因的分离克隆及其在植物发育代谢中的功能研究提供一定的信息；丁云花等[33]开展萝卜D染色体在7号连锁群定位的研究，证实了定位有抗线虫基因HsIRapls的7号连锁群对应于具线虫抗性效应的萝卜D染色体；何启伟等[34]采用RT-PCR的方法，先后从萝卜花蕾中克隆了萝卜花青素调控基因和开花关键基因LFY基因片段，并将后者构建了dsRNA抑制双元表达载体pPOK-A-I-S-L，转入到萝卜品种短叶13中，获得了T0代种子。

6 结语

我国萝卜种质资源丰富，类型和品种繁多，且有多种食用方法。同时，萝卜富含淀粉酶、硫代葡萄糖苷、VC、莱菔子素，以及其他维生素和多种矿物质，有药用价值和保健作用，是颇受欢迎的保健食品。目前，除东亚国家大面积种植萝卜外，国际上其他国家则只有少量栽培，品种类型也少。因此，调整和把握好育种目标，改进和提高育种技术水平，育成各具特色，优质、抗病、稳产、适应性广的品种，并繁育出优质种子，不仅能够加快国内品种更新，而且完全有条件推向国际市场。

可以预见，分子标记技术和原生质体融合技术等现代生物技术在萝卜育种中将有更大的应用空间。传统育种技术仍是重要的育种手段，现代生物技术与传统育种技术相结合，必将大大加快萝卜育种进程，创造出更多优异的种质资源，培育出更多优良性状的萝卜新品种。例如，采用小孢子培养技术，加快育种材料的纯合过程，并配合强化室内和田间主要经济性状的鉴定、选择，缩短优良亲本系选育年限。对耐抽薹性、耐寒性、耐热性等主要经济性状进行分子标记研究，辅助常规亲本系及杂种一代的鉴定与选择，提高选择的效率和准确性。运用基因工程，转化特异基因，创新萝卜种质，利用原生质体融合技术、诱变技术丰富育种材料。

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