不同条件下邻苯二酚及其衍生物捕获自由基性能研究

渠 畅，潘 晶，庄长福，张加研，田 珩，秦永剑

（1.西南林业大学材料工程学院，云南 昆明 650224；2.广西民族大学，广西林产化学与工程重点实验室，广西 南宁 530006）

抗氧化剂和氧自由基方面的研究是近年来生物化学和医学界非常引人关注的领域。自由基与人的病理、生理有密切关系，防止自由基的氧化作用，对防治疾病保障健康具有积极意义[1]。自由基可通过体内抗氧化剂来清除，但机体内抗氧化剂往往不足，所以寻找外源性抗氧化剂对于预防疾病发生和保持机体健康是十分有益的[2]。

研究发现多酚类化合物可以延缓肿瘤的发作，减慢肿瘤的形成，提高认知功能，抑制低密度蛋白氧化及抑制血小板凝集等功能[3]，这些功能都与酚羟基的抗氧化性能有关。具有邻二酚羟基的酚类化合物是高效抗氧化剂。邻二酚羟基的邻位酚羟基形成分子内氢键，有利于酚氧自由基的稳定；邻二酚羟基的酚羟基与氧自由基反应形成共振稳定的半醌式自由基而中断链式反应[4]。抗氧化剂形成半醌式自由基越稳定，其清除自由基的能力就越强。

在不同环境下，抗氧化剂的活性也有很大变化。Ingold 等人研究发现，同一抗氧化剂在不同的溶剂中与相同自由基反应的速率常数差别很大[5~8]。Nau等人报道在模拟生物膜体系中，随着pH值的降低，维生素C 的抗氧化活性增强[9]。

本文首先研究邻苯二酚及其衍生物（4- 甲基儿茶酚、对叔丁基邻苯二酚和咖啡酸）捕获ABTS+·自由基的性能，然后通过改变溶解邻苯二酚及其衍生物的溶剂的酸碱性，在不同条件下研究这些化合物的抗氧化性。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

精密电子天平JJ200，紫外可见分光光度计TU-180。

邻苯二酚，4- 甲基儿茶酚，咖啡酸，对叔丁基邻苯二酚，ABTS，无水乙醇，冰乙酸，吡啶，过硫酸钾（均为分析纯）。

1.2 试样制备

称取一定质量的邻苯二酚、4- 甲基儿茶酚、对叔丁基邻苯二酚、咖啡酸，分别用无水乙醇溶解并定容至100mL，制成样品母液，得到母液浓度为0.1mM。分别取 3 组 0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mL 0.1mM 的母液于5个10mL的容量瓶中作为样品待测液。

1.3 ABTS+·清除能力测定

配制ABTS+·储备液：配制4.0mM的ABTS及1.41mM的K2S2O8的蒸馏水溶液2.0mL，在室温、避光条件下静置16h。配制ABTS+·测定液：将ABTS+·储备液用无水乙醇稀释至100mL，使ABTS+·溶液终浓度约80μM。

测定：取2mL ABTS+·测定液及2mL 样品待测液加入同一比色管中，震荡摇匀30min后，测定其在734nm 波长处的吸光度（Absdetect），再测定2.0mL ABTS+·溶液与2.0mL无水乙醇的吸光度（Absref）作为空白组。每隔一段时间测定1次，至2次所测相差10%以内反应达到平衡，每组均为3次平行测量平均值。ABTS+·清除率按以下公式计算：

ABTS+·/% = （Absref-Absdetect）/Absref

以乙醇为溶剂溶解邻苯二酚及其衍生物，测试捕获ABTS+·的能力，然后在反应体系中引入醋酸和吡啶，分别使其浓度达到130mM，并测试捕获ABTS+·的能力。

2 结果与分析

2.1 乙醇溶剂中邻苯二酚及其衍生物与ABTS+·的反应

由图1邻苯二酚及其衍生物在乙醇中与ABTS+·作用达到平衡时捕获ABTS+·时的IC50，列于表1。根据表1中的数据，可以发现在无水乙醇溶剂中，捕获ABTS+·的相对抗氧化能力顺序为：咖啡酸＞邻苯二酚＞4- 甲基儿茶酚＞对叔丁基邻苯二酚。这是和抗氧化剂的结构有关。邻位酚羟基可以形成分子内氢键，有利于生产更稳定的酚氧自由基，抗氧化剂形成的自由基越稳定，其清除自由基的能力就越强。由于咖啡酸具有较大的共轭体系，其羟基与ABTS反应后形成的自由基可被大的共轭体系所稳定，此外，咖啡酸中的取代基的双键增强了共轭效应，使酚羟基的氢离子更容易离去，因此捕获自由基的能力最强。而甲基和叔丁基取代基在共轭基团中是吸电子基团，使酚羟基的氢离子不容易被脱去，叔丁基的吸电子效应还强于甲基，更不容易脱去氢离子。

图1 邻苯二酚及其衍生物 - 醇 -ABTS+·

2.2 酸性条件下邻苯二酚及其衍生物与ABTS+·的反应

由图2邻苯二酚及其衍生物在冰醋酸中与ABTS+·作用达到平衡时捕获ABTS+·时的IC50，列于表1。由图2及表1中的数据，可以看到这4种抗氧化剂在冰醋酸 - 乙醇溶液中时相对抗氧化能力的IC50和在乙醇中变化不大。这说明酸的加入减弱了抗氧化性。这是因为冰醋酸和抗氧化剂本身都是氢原子给予体，一方面冰醋酸抑制了邻苯二酚及其衍生物OH给出氢离子的能力，而另一方面冰醋酸作为氢原子给予体也电离出一部分氢离子，从而使邻苯二酚及其衍生物的IC50值基本不变。

图2 邻苯二酚及其衍生物 - 酸 -ABTS+·

2.3 碱性条件下邻苯二酚及其衍生物与ABTS+·的反应

由图3邻苯二酚及其衍生物在吡啶中与ABTS+·作用达到平衡时捕获ABTS+·的IC50，列于表1。由图3中的数据，可以发现在吡啶 - 乙醇溶液中，邻苯二酚及其衍生物捕获ABTS+·的IC50值比在乙醇溶液中减小很多，这说明吡啶的加入，增强了抗氧化剂的清除自由基的能力。这是由于在吡啶的碱性条件下，促进抗氧化剂更容易电离出氢离子，从而使邻苯二酚及其衍生物的IC50值减小，清除自由基能力增强。

图3 邻苯二酚及其衍生物 - 碱 -ABTS+·

表1 在乙醇，醋酸- 乙醇，吡啶- 乙醇溶液中，邻苯二酚及其衍生物捕获ABTS+·的IC50值

3 结论

（1）邻苯二酚及其衍生物对自由基ABTS+·清除能力与抗氧化剂的结构有关。邻位酚羟基形成分子内氢键，有利于生产更稳定的酚氧自由基抗氧化剂。咖啡酸中的双键增强了共轭效应，使OH的氢离子更容易离去。而甲基和叔丁基取代基在共轭基团中是吸电子基团，使OH的氢离子不容易被脱去。

（2）邻苯二酚及其衍生物对自由基ABTS+·清除能力与溶剂的酸碱性有关。在酸性条件下，冰醋酸抑制了邻苯二酚及其衍生物给出氢离子的能力，但作为氢给予体也电离出部分氢离子，清除能力变化不大；碱性条件下，促进邻苯二酚及其衍生物更容易电离出氢离子，清除自由基能力增强。

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