红三叶异黄酮抗氧化功能及其药理作用研究进展

师旭彤，郭凤霞，祁 娟

（1.山东大学药学院，山东 济南 250012；2.甘肃农业大学 生命科学技术学院，甘肃 兰州 730070；3.甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070）

红三叶（Trifoloium pratense）又名红车轴，是豆科三叶草属（Trifolium）多年生草本植物。原产于欧洲和西亚，现广泛分布于世界各地，中国东北、华北、华南地区均有栽培。红三叶含有黄酮类、蛋白质、氨基酸、糖类和维生素等多种具有价值的成分，尤其是异黄酮因有植物雌激素样作用和黄酮类物质的抗癌作用而备受关注。20世纪40年代以来，有关红三叶异黄酮有效成分及疗效的研究日益受到重视，已开发出药品和保健食品达百余种。目前，红三叶异黄酮的提取物是国际上公认的治疗妇女更年期综合症疗效显著的植物性药，其销量在美国多年来一直名列前十位［1］。

甘肃省岷县一带已形成规范化种植基地，在地区特色经济发展和土壤轮作倒茬改良中起到积极作用。但人们对红三叶的药用价值和保健价值认识尚不全面。本文对红三叶异黄酮的抗氧化性及在防治疾病上的应用情况进行综述，以期对国内一些科研及医药生产单位更好地开发利用提供理论依据。

1 红三叶的形态特征及生物学特性

红三叶为豆科多年生草本植物，高30～80cm，侧根发达，茎直立或斜升，叶互生，三出复叶，小叶椭圆状卵形至宽椭圆形，叶缘有不明显的细齿，小叶无柄；花序腋生，头状，具大型总苞，总苞卵圆形；花萼筒状，花冠蝶形，淡红色、紫色或淡紫红色；荚果小，包被于萼内，含种子1粒，椭圆或肾形，棕黄色或紫色，千粒质量为1.5g［2－5］。花期8～10月，红三叶为2倍体植物。

红三叶适宜在我国亚热带高山低温多雨地区种植，喜温暖湿润气候，最适宜生长在夏天不太炎热，冬天温暖，年降水量1 000mm的地区。生长最适温度为15～25℃，能耐－8℃低温。无霜期150～220d，生长良好。喜中性至微酸性土壤，适宜的pH为5.5～7.5。红三叶原产于欧洲和西亚，现在欧洲各国及澳大利亚、新西兰、美国等国广泛栽培［4］。在我国新疆、云南、贵州、浙江、湖北、江苏等省均有野生分布［6］。目前，红三叶有许多适应不同环境的优良品种［7］。并且研究发现各个时期异黄酮含量均以叶片中最高，花次之，然后是根，茎、叶柄和托叶［8］。

2 红三叶异黄酮种类

自20世纪50年代开始，人们对红三叶植株的化学成分进行了大量的研究，已分离鉴定了异黄酮、黄酮、蛋白质、氨基酸、糖类、挥发油和维生素等多类化合物［9］。但最受关注的是黄酮类物质，其中，具有“植物雌激素”之称的异黄酮类格外受人关注。异黄酮是一种广泛存在于植物界的一大类化合物，目前，植物中已知的异黄酮有700余种，主要存在于大豆、红三叶、苜蓿等豆科植物，尤以红三叶中异黄酮的含量最高［10］。从50年代以来，Pope、Bate－Smith、Guggolz等科学家先后从红三叶植株中分离到许多异黄酮类物质［11－13］，其中，以鹰嘴豆芽素A（Biochanin A），芒柄花素（Formononetin），染料木素（Genistein），大豆苷元（Daidzein）等4种为主［14］。

3 红三叶异黄酮的抗氧化作用

3.1 对脂质过氧化作用

红三叶异黄酮可以抑制膜质过氧化。异黄酮能保护DNA不被氧化破坏，有效消除紫外线引起的DNA损伤［15］。异黄酮还能抑制小鼠肝组织匀浆液中脂质的过氧化作用，能防止 Vc的氧化［16］。姜义宝等［17］通过在饲料中添加红三叶异黄酮，研究其对肉鸡免疫器官、免疫球蛋白及抗氧化性能的影响，发现红三叶异黄酮提高了血清中谷胱甘肽过氧化物酶活性，降低了丙二醛（MDA）含量，能够明显改善肉鸡生产性能、调节免疫和提高机体的抗氧化性。

3.2 清除自由基的伤害

活性氧和自由基是引发人体衰老、癌变和细胞损伤的重要原因。红三叶中含有大量的具有潜在的生物抗氧化和良好的清除自由基功能的异黄酮多酚化合物，且其清除能力与异黄酮的种类和含量有一定的关系。红三叶提取物中的异黄酮和多酚化合物具有良好的生理健康促进作用，被认为是有效的抗氧化剂、自由基清除剂和功能食品增补剂［18］。在血红蛋白与过氧化氢所致的卵磷脂过氧化试验中，大多异黄酮均有抑制作用，其中，染料木素和芒柄花素有强抑制作用，其抑制作用与抗氧化剂、维生素E和SOD相当［19］。朱宇旌等［7］研究证实，添加红三叶黄酮粗提物对猪油具有良好的抗氧化作用，另外Vc和VE等对红三叶黄酮粗提物具有明显的协同抗氧化作用。

3.3 提高抗氧化酶的活性

红三叶异黄酮还可提高抗氧化酶的活性。试验表明，红三叶异黄酮可显著提高小肠、皮肤等器官的抗氧化酶数量，诱导机体抗氧化活性升高。杨丽珍等［20］用红三叶异黄酮高、低剂量及大豆异黄酮、倍美力组对比治疗衰老大鼠实验，说明红三叶异黄酮通过提高SOD活性，降低MDA浓度，达到提高机体清除氧自由基能力，从而有效延缓衰老。魏朝良等［21］对黄酮类化合物及清除自由基机制的探讨发现，红三叶异黄酮具有较强的抗氧化性与分子结构具有密切关系，黄酮类化合物抗氧化作用是通过酚羟基与自由基反应形成稳定半醌式自由基结构，在一定程度上增加酚羟基，抗氧化活性增加。

大量研究表明，红三叶异黄酮提取物对消除自由基和抑制脂质过氧化均有较强作用，能有效延缓油脂脂质过氧化，表现出一定的抗氧化活性。目前，对红三叶异黄酮抗氧化活性的研究，多集中在其几种单体的研究，而对红三叶总黄酮抗氧化及体外清除自由基及其抗氧化效果如何有待进一步研究。

4 红三叶异黄酮的药理作用

4.1 发挥雌激素样作用

目前国内外学者对红三叶研究最多的就是其雌激素样作用。红三叶异黄酮为植物雌激素，结构与人体雌激素类似，可与雌激素接受器相互作用。专家认为，可能是由于异黄酮的双羟基酚式结构与动物体内雌激素己烯雌酚和雌二醇结构相似，故能选择性的与雌激素受体结合发挥雌激素样作用。红三叶异黄酮作为唯一植物雌激素有其独到之处，他们具有双向调节作用，当人体雌激素水平高时，可抑制激素分泌，反之，当人体雌激素水平低时，能提供额外的雌激素样作用。临床上既用来治疗妇女体内雌激素水平升高时的经前期综合症，又被用于治疗雌激素降低时的更年期综合症和绝经［22－26］。另外，也能治疗雌激素病，例如子宫肌瘤、子宫内膜异位及骨质疏松症等。红三叶中发挥这种雌激素样功能的化合物主要有鹰嘴豆芽素A、芒柄花素、染料木素和大豆黄素，其中，染料木素活性最强，和雌激素受体的结合力也最强，大豆苷元次之，芒柄花素活性和与受体的结合能力最弱，鹰嘴豆芽素A无结合力，但有弱雌激素活性，异黄酮甲基化或糖苷化后会使活性降低［4，5］，红三叶积累刺芒柄花素的能力最高，并且自真叶的愈伤组织异黄酮含量最高［27，28］。此外，香豆雌酚也具有雌激素样作用［29］。人体补充红三叶异黄酮可以预防和治疗激素分泌失调导致的一系列相关疾病。Potter等［30］用异黄酮和雌二醇来抑制或预防妇女由于内源性雌激素减少而引起或加重的疾病如骨质疏松、认知功能丧失、体重增加、身体脂肪量增加、血管收缩症状等。Kelly等［31］用含芒柄花黄素和大豆苷元的药剂或膳食补充物来预防和治疗面颊热、睡眠紊乱等。另据报道，异黄酮植物雌激素也被认为是一种特殊的营养物质并对家畜的生产性能可能存在潜在的影响，即能够替代抗生素和相关激素等生长促进剂，而成为养殖业研究的一个热点［32］。

4.2 减轻动物机体更年期综合症

近年来研究发现绝经期综合症（PMS）有发病年龄提前、发病率上升的趋势。杨丽珍等［33］研究了红三叶异黄酮对更年期大鼠下丘脑β－内啡肽的作用，表明红三叶异黄酮具有改善更年期雌性大鼠下丘脑β－EP神经元功能，从而起到稳定内环境和缓解的作用。同时发现，红三叶异黄酮能显著改善妇女更年期综合征。更年后期妇女潮热的发病率，在欧洲和北美高达70%～80%，而在日本、中国和东南亚国家，则分别为25%，18%和14%。这种差异是由于这些国家人们摄入的植物雌激素水平不同所致。有的学者认为红三叶异黄酮在治疗绝经期妇女热潮红能减少热潮红发生频率；而有些学者则认为植物雌激素如大豆提取物，红三叶提取物不能改善热潮红或其他绝经期症状［13］。这一问题需要进一步进行验证。

4.3 提高动物机体免疫能力

异黄酮能提高动物机体细胞免疫、体液免疫。秦亮［34］研究红三叶和红芪两种中草药提取物对小鼠免疫功能和肉鸡生产性能的影响时发现，适量的红芪粗多糖和红三叶总黄酮提取物能够增强小鼠非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫功能，促进免疫器官的发育。刘宝剑［35］对红三叶总黄酮抗氧化作用及其对免疫功能的影响研究发现红三叶总黄酮在适宜浓度范围内具有增强小鼠免疫功能的作用。

4.4 防止钙流失及骨质疏松

骨质疏松症是一种与年龄、性别和激素缺乏相关的疾病。更年后期妇女卵巢雌激素分泌量的急剧减少是引起骨质中钙流失和骨质疏松的首要原因。研究发现植物雌激素异黄酮具有预防骨吸收和增加骨密度的作用。红三叶异黄酮对维甲酸致小鼠骨质疏松有一定的预防作用，其机制可能与其减缓雌激素水平降低，抑制骨高转换有关［36］。李颖等［37］对红三叶异黄酮对去卵巢大鼠骨质疏松防治作用的实验研究发现，红三叶异黄酮对去卵巢引起的大鼠骨质疏松症具有明显的防治作用。有关异黄酮预防骨质疏松的机制，现在认为，异黄酮作为较弱的雌激素激动剂或拮抗剂，与破骨细胞内的受体结合后抑制其破骨活动和骨吸收过程，加速骨形成过程。陈琦等［38］研究结果表明，红三叶异黄酮通过提高血清雌激素水平，增加成骨细胞活性，降低骨高转换率以及减少骨量丢失等多种途径，能有效防治绝经后骨质疏松症。宁鸿珍［39］等研究红三叶异黄酮对去卵巢大鼠骨密度及骨代谢的影响，结果表明红三叶异黄酮不仅可以维持去卵巢大鼠骨密度，而且可以替代雌激素对骨代谢有一定的调节作用。

4.5 防治心脑血管性疾病

近年来对于红三叶异黄酮降胆固醇的研究取得了一定的进展，国外一些研究在这方面申请了多项专利。Empie等［40］从红三叶、苜蓿等植物原料中提取出异黄酮、皂甙等化学成分，然后把它们按一定比例混合，用混合物治疗心脏血管性疾病如血液胆固醇过高、心脏病、血管功能异常。Atkinson等［41］研究红三叶异黄酮对心血管风险因子的作用，认为饮食中补充红三叶衍生物对更年期妇女心血管风险因子有一定的保护作用。Nestel等［42］实验显示摄入红三叶异黄酮，对改善全身组织动脉血管的顺应性来减少冠心病冠状动脉硬化性心脏病的风险因素有显著的效果。刘绍东等［43］用红三叶提取液对实验性高脂血症大鼠血脂的影响进行研究，红三叶提取液能明显降低高脂血症大鼠的血脂以及血浆AngⅡ和ET水平，可能对高脂血症和动脉粥样硬化症有防治作用。

4.6 防治癌症

红三叶提取物能通过抑制相关酶类等多种途径而发挥抗癌作用。研究表明，人体摄入动物性激素可诱发或加剧癌症的发生，但若补充植物性激素则可以抑制癌细胞的繁殖并且可以消灭癌细胞。Empie等［37］从红三叶、苜蓿等植物原料中提取出异黄酮、皂苷等化学成分，制成的混合物治疗前列腺癌、皮肤癌、乳腺癌、结肠癌、尿道癌等。Roberts D W等［44］研究表明，鹰嘴豆芽素A和（或）芒柄花素可通过直接竞争细胞色素结构发挥抗癌作用或间接通过它们的代谢产物大豆黄素和染料木黄酮抑制CYP1B1而发挥抗癌作用。Mizunuma等［45］用两种异黄酮（鹰嘴豆芽素A、大豆黄素），通过小鼠乳房肿瘤病毒诱导的自发乳腺癌细胞模型来验证异黄酮的抗癌作用，认为系统的抗癌效果可能不是通过大豆黄酮或牛尿酚，而是鹰嘴豆芽素A或染料木黄酮，这两种物质在肠道微生物群的代谢过程中可能扮演了一个抑制乳腺癌的角色。Slater等［46］研究，在饲喂红三叶异黄酮小鼠的前列腺上皮细胞显示雌激素β受体和上皮细胞钙粘蛋白显著的增加，表明红三叶异黄酮对于前列腺增生能减少潜在的致瘤性转化Renea等［47］研究表明，饮食中添加红三叶异黄酮可以通过诱导前列腺癌细胞的凋亡抑制前列腺癌的发展。尹春萍等［48］研究红三叶总异黄酮对人乳腺癌MCF－7细胞增殖和凋亡的影响发现，红三叶总异黄酮可抑制MCF－7细胞增殖并诱导其凋亡，具有抗肿瘤作用。

4.7 预防肥胖症

据统计数字显示，25%的美国人和27%的加拿大人的体重超标。肥胖尤其上部躯体肥胖会诱发高血压、胰岛素排斥等疾病。Ingram等［49］用含异黄酮的合成物治疗肥胖症，避免了其他减肥药品因含有咖啡因和安非他刺激物加重心脏肌肉和血管的负担，带来不利影响。该合成物通过抑制食欲，摄入少量食物使胃具有饱感来治疗肥胖。

4.8 保护皮肤免受紫外线伤害

皮肤受到紫外线照射会引起表皮细胞DNA和T型淋巴细胞免疫系统的损坏。若长期暴露于紫外线照射下会引发癌症。异黄酮作为一种遮光剂，具有良好的保护皮肤、修复损伤的作用。红三叶富含牛尿酚异黄酮，它能保护皮肤免受紫外线的辐射并能抑制皮肤癌的形成［50］。Kelly等［51］用含有芒柄花黄素、鸡豆黄素、染料木黄酮、二氢染料木黄酮等载体混合制成的产品来保护皮肤免受紫外线照射造成的伤害。

红三叶异黄酮具有毒性低，药理作用众多等优点。不但在预防和治疗动脉硬化、骨质疏松、更年期症状、癌症等方面得到广泛应用，而且在调节激素平衡、抗自由基、抗菌、消炎、降血压等多方面也发挥着巨大作用。最近的研究发现，红三叶异黄酮还可以防止味精等食品添加剂对身体健康的破坏。另外，异黄酮类化合物在畜牧业上也有广阔的应用前景，是一种值得推广的饲料添加剂。随着对红三叶异黄酮生理功能研究的不断深入，人们也在不断地扩大它的应用领域，但尚需要对它进行更加深入的研究，如对异黄酮类化合物长期过量使用是否具有毒性等方面。红三叶的保健食品和医药产品已大量进入国际市场，但国内对这方面的研究还相对较少。因此，有必要对该属植物进行更全面、更深入的研究，充分发掘它们的潜在利用价值，从而为人类带来更大的经济效益和社会效益。

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