阿尔茨海默病脑脊液和血液生物学标志物的研究进展*

彭竹芸 综述，晏 宁，晏 勇△审校

(1.重庆医科大学附属第一医院神经内科 400016；2.重庆医科大学附属大学城医院神经中心 401331)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是老年期痴呆中最常见的类型,发病率为1.0%～2.0%，并随着年龄增长而增高。AD发病率在中国65～75岁人群中为4.8%，>75～85岁为11.5%，85岁以上大于30.0%。AD不仅严重危害老年人群的身体健康，并给家庭和社会增加了沉重的负担。目前对确诊的中、重度AD尚无特效治疗方法，而早期识别和干预该病对患者、家庭和社会均有极其重要的意义。Prince等[1]代表国际痴呆协会所写《2011世界AD报告》中提出AD能够早期诊断，指出早期诊断和干预可明显改善AD患者的认知功能，推迟患者入住医疗和看护机构的时间，且早期诊断的效益显著。早期诊断就是尽早发现症状很轻微、特别是发现仅有脑部AD病理改变而无临床症状的临床前期AD(preclinical phase AD，PCAD)患者。近年来对AD早期诊断的探索主要集中在脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)和血液中生物标志物研究，本文就此进展进行综述。

1 CSF中相关标志物

目前对CSF中生物标志物的研究多聚焦β样淀粉蛋白(amyloid β-protein，Aβ)和tau蛋白等含量异常。证实二者改变最直接最可靠的方法是脑组织活检，但临床广泛开展较困难。因CSF直接与中枢神经系统(central nervous system，CNS)的细胞外空间联系，脑的生物学变化会在CSF中反映出来，故检测CSF中Aβ和tau蛋白等能较客观地反映脑组织的病理、生理变化。

1.1Aβ AD最主要的病理特征性改变之一是细胞外聚集的Aβ构成老年斑(senile plaque,SP)。淀粉样前体蛋白(APP)经过一系列酶切过程产生Aβ。生理情况下，APP经过α途径代谢不生成Aβ。病理状态下，APP经β途径代谢产生过多不溶性Aβ，导致脑组织大量Aβ沉积，从而使CSF中Aβ水平降低。老年斑的核心成分是Aβ40和Aβ42，疏水性的Aβ42比Aβ40的毒性更强，更易聚集。AD患者CSF中Aβ42的水平较Aβ40更低。因Aβ40变化较小，Aβ42/Aβ40比值对于AD的诊断更有帮助。Carol等[2]报道CSF中Aβ40降低对AD诊断的敏感性为80.0%，特异性为90.0%，Aβ42降低的敏感性87.0%，特异性90.0%；两个指标联合检测Aβ40/Aβ42比值在诊断AD的敏感性大于95.0%，特异性为90.0%。Welander等[3]用Aβ标准肽定量研究发现散发性和家族性AD患者脑Aβ斑块和额叶皮质区存在Aβ43，提出Aβ43比Aβ40更常见，毒性可能比Aβ42更强，是非常重要的生物学标志物。但目前还未被广泛认可，有待进一步研究。曾有较多对Aβ14、Aβ15、Aβ16、Aβ25、Aβ32、Aβ35、Aβ37、Aβ38、Aβ39等其他单体在AD患者CSF中变化研究，但其敏感性和特异性均较低。

1.2tau蛋白 tau蛋白是神经元内维持微管结构稳定的细胞内蛋白。在正常状态下，CSF中含有少量tau蛋白，随着年龄的增长而增多。AD患者脑神经元中tau蛋白过度磷酸化并与微管蛋白分离，聚合成不溶的成对螺旋纤维丝(PHF)，最终形成神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)，tau蛋白释放入CSF中，总tau蛋白(T-tau)显著增加。磷酸化tau蛋白(P-tau)是NFTs的主要成分，可在39个位点异常过度磷酸化，造成轴突传导功能障碍。目前国际老年痴呆协会建议将T-tau和P-tau作为诊断AD的生物标记物。

有研究表明，AD、血管性痴呆和额颞叶痴呆患者T-tau水平增高，在90%进展为AD的轻度认知障碍(MCI)患者的CSF内，T-tau水平显著增加，而稳定型MCI不增加[4]。Mattsson等[5]多中心检测AD组(MCI发展为AD 271例)和非AD组(MCI发展为其他痴呆59例)患者CSF中tau蛋白，显示AD组P-tau181和T-tau高于非AD组。de Souza等[6]证实AD患者的海马容积与CSF中P-tau和T-tau的含量相关，而与CSF中Aβ不相关，原因可能与神经元缺失和AD病理、生理过程相关。P-tau181和P-tau231可用来鉴别AD与其他类型痴呆[7]。MCI患者CSF和脑组织中BACE1蛋白及酶活性升高，Aβ42水平降低、T-tau和P-tau升高等具有预示MCI向AD转化的价值。Tau蛋白其他亚型还有P-tau199、P-tau235、P-tau396和P-tau404等，在AD和其他类型痴呆均有异常，某些亚型可作为痴呆早期诊断的生物学指标。但其他神经变性疾病如克-雅脑病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)、路易体痴呆(dementia with Lewy bodies，DLB)等患者CSF 中tau蛋白水平也可升高。有学者发现AD患者CSF中tau蛋白水平高于多发性梗死性痴呆、血管性痴呆、非AD痴呆以及MCI和其他痴呆患者。

1.3Aβ联合tau蛋白 实践证明检测单个生物标志物的敏感性和特异性明显弱于多个标志物联合检测。Blennow等[8]对有痴呆高危因素的认知功能障碍患者联合检测CSF中Aβ42、T-tau和P-tau蛋白，结果显示一例患者常有多个标志物同时异常，较单一标志物诊断AD具有更高的特异性和准确性。此3项指标联合检测对预测MCI发展为AD的特异性和敏感性约为85.0%。Tapiola等[9]选择交叉研究123例可能AD患者的CSF，以Aβ42下降、P-tau升高和Aβ42/P-tau比值诊断AD，其敏感性为91.6%、特异性为85.7%。

1.4神经元蛋白和其他替代标记物 其他脑淀粉样蛋白沉积标志物包括APP、淀粉前体样蛋白(Amyloid precursor like protein，APLP) 。APLP有3种亚型即APLP1β25,APLP1β27 和APLP1β28。Yanagida等[10]报道在散发性和家族性AD患者CSF中 APLP1β28水平显著增高。而在家族性AD患者CSF中Aβ42却没有降低，认为APLP1β28可替代Aβ42而作为诊断标记物。 分拣蛋白相关受体(sortilin-related receptor,SORL1，又称 SorLA 或LR11) ，是一种跨膜神经元分拣蛋白，引导APP进入产生Aβ的再循环通路。SORL1的下降与淀粉样斑块、NFTs呈负相关。Ma等[11]报道在AD患者CSF中SORL1显著降低，建议其可作为AD诊断性标志物。神经元损伤后漏出蛋白-类视锥蛋白1(visinin-like protein 1，VLP-1)在AD患者的CSF中高表达。该蛋白预测AD的敏感性和特异性与CSF 中T-tau、P-tau、Aβ42相似[12]。有学者报道异构前列腺素(isoprostanes)和超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase,SOD)，可作为AD和MCI患者氧化应激损伤的标志物。

2 血液中的生物学标志物

2.1血浆中的Aβ 血液标本较CSF获取更方便，血液生物标志物检查一直是学者们探索的方向。目前研究显示AD患者血浆中存在Aβ变化而tau蛋白检测较为困难。血浆Aβ42水平变化与CSF并非同步变化。Ringman等[13]研究发现FAD基因突变型患者血浆Aβ42、Aβ42/Aβ40比值在出现临床症状前已明显升高，而CSF中Aβ42/Aβ40比值降低、T-tau和P-tau升高。Schupf等[14]跟踪研究无认知损害的老年人群约4.5年，发现在实验早期血浆中Aβ42高表达，而转变成痴呆后血浆中Aβ42下降且血浆中Aβ42/Aβ40比值也下降。Blasko等[15]也报道血浆中Aβ42高表达组较对照组在5年后患痴呆的风险增大。AD患者早期血浆与CSF的不同步变化可能与血脑屏障较完整有关，而晚期血浆和CSF中Aβ均降低的一致性可能与中枢与外周血中Aβ的平衡有关。血浆中Aβ42水平升高、Aβ42/Aβ40比值降低者是进展为AD的高度危险因素，可作为预测PCAD和MCI患者发展为AD的生物标志物。也有研究表明血浆中Aβ没有变化。家族性AD和唐氏综合征时，血浆中的Aβ水平升高，但是在散发性AD患者血浆中Aβ水平并不一定增高。其结果的多样性可能与Aβ的疏水性和血浆中Aβ来源于周围组织而不是脑组织相关。

2.2血浆炎性反应因子 脑内不溶性Aβ过度沉积可引起一系列炎性反应。血浆其他标志物包括炎性反应因子CD40在AD患者中表达较显著。CD40是肿瘤坏死因子受体超级家族中的成员之一，与Aβ的代谢相关。可溶性CD40(sCD40)在AD患者的血浆中比在同龄对照组的血浆中高表达。Buchhave等[16]检测136例MCI和30例同龄对照组血浆sCD40和CD40的同源配体(CD40L)，以此为基线，在随后临床观察4～7年，MCI转变AD的60例患者组二者均增高，而在认知未继续下降或转为血管痴呆组二者均无变化，提示CD40可作为AD的早期的标志物。AD病理、生理过程涉及炎性反应，O′Bryant等[17]选用白细胞介素(IL)、血管紧张素转化酶(ACE)、肌酸激酶MB(CKMB)、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、巨噬细胞炎性蛋白1(MIP1)、组织抑制剂的金属蛋白酶1(TIMP1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等炎症相关血清蛋白作为测试集的逻辑回归模型诊断AD，其敏感性为80.0%、特异性为91.0%。此模型计算再加上性别、年龄、教育及载脂蛋白E(ApoE)的准则，其敏感性可为94.0%、特异性为88.0%。AD患者CD44在淋巴细胞膜上表达增强,CD44是黏附分子甚至在中枢神经系统也参与免疫反应，其增强表达似乎与p53升高相一致[18]。有研究还认为AD患者血清中IL-1β、IL-6、TNF-α明显升高，MCI患者IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α明显升高。在对MCI患者的追踪调查中发现，进展为AD的MCI患者CSF中有较高的TNF-α和IL-8水平均增高，给AD的诊断和治疗提供了新的途径。

2.3周围系统其他标志物 Khan等[19]报道磷酸化的细胞外信号调节激酶(ERKs)1与ERKs 2的比值指数，在包括解剖病理验证的病例样本中诊断AD比临床标准诊断具有更高的敏感性和特异性，特别是诊断早期(AD期第一个4年)。 在经临床和病理诊断AD痴呆患者各病程阶段血清中PlsEtn水平均显著下降,并与痴呆的严重程度相关，在患者症状加剧时降低更显著[20]。

3 基 因

3.1p53 p53基因是抑癌蛋白，又称“基因组的守护神”。它通过产生一种能引发细胞凋亡的蛋白质来保护人类细胞，或是在DNA受到严重损伤时促使细胞自杀，以阻止遗传突变的扩展和癌症的形成。当p53受损或缺失时，就会导致癌症。而p53极度活跃，瘤抑制蛋白比正常水平更高时，衰老进程就会加速并且寿命缩短。主要机制是p53使细胞内结构折叠导致阻力增加而致细胞死亡，导致Aβ沉积，而成为AD早期的标志物。有学者发现AD组患者血液中p53突变型高于非AD组，且p53突变型与年龄相关，与病程和简易精神状态量表(MMSE)无关。p53预测MCI患者2年后发展为AD的敏感性和特异性均较强[21]。

3.2微RNA(miRNA) miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,通过与靶基因mRNA的3′非翻译区(3′UTR)结合在转录后水平调控基因表达。miRNA在脑发育、神经特异性以及突触可塑性等方面有重要的作用，miRNA与AD相关的APP、BACE-1等基因的靶mRNA相互作用，与AD等神经变性疾病有密切的关系。体外试验发现miRNA-29a/b-1的表达与Aβ产生的因果关系支持在散发AD中特定的miRNAs与淀粉样途径相关[22]。 Cogswell等[23]的研究表明在AD患者中miRNA在CNS和CSF中均异常表达。在Braak分级5～6级的AD患者小脑、海马和额中沟区发现miR-9、miR-132下降。在AD患者CSF中miR-146b水平下调，而在脑中miR-138则高表达。miRNA在脑及CSF的变化，使其可能成为AD早期诊断的标志物。但神经元或者其他神经细胞细胞质中miRNA和细胞外的miRNA的变化及相关性等尚不明确，因此能否作为确诊AD的生物标志物还需进一步研究。

3.3基因多态性 大量研究表明ApoE的多态性与AD的关系密切。晚发性家族型AD患者ApoE的等位基因ε4频率增多。ApoE4与CSF中低Aβ1-42、高T-tau、高P-tau及高tau/Aβ联合可改变测试性能和能力，能够区分出不同程度的认知损害，ε4更能预示患者的认知水平进一步下降[24]。Elias-Sonnenschein等[25]系统分析得出，ApoE4与MCI发展成为AD的高危因素相关，为了更好的预防MCI转为AD，ApoE4是很好的筛选工具。家族性早发型AD患者中75%有早老蛋白-1(Presenilin-1，PS1)的多态性异常，多为点突变。多于50%的早老基因错义突变可引起早发性AD。AD患者早老蛋白-2(Presenilin-2，PS2)基因突变体与GSF的Aβ含量相关，研究基因对标志物的影响可指示寻找更好的治疗方法[26]。目前对于基因的检测仍面临很大的问题，寻找基因作为标志物需要更大的样本和更多的人力财力。

4 展 望

近年来对诊断AD生物标志物的探索研究中较为成熟的是CSF中Aβ(特别是Aβ42及Aβ42/Aβ40比值)和tau蛋白及其亚型的变化。但其特异性、敏感性和易重复性等还需进一步的研究。而血液、尿液和唾液等生物标志物的研究还有待探索，除Aβ、tau蛋白以外的其他痴呆相关生物标志物的研究亦应拓展，多种敏感性强和特异性高的诊断性标志物组合，可能对AD特别是无症状的PCAD和早期AD进行早期诊断及干预，以及判断AD药物治疗效果更有裨益。

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