新城疫病毒在肿瘤治疗中的研究进展

李亚琳

（渭南师范学院化学与生命科学学院，陕西渭南714000）

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是单股负链RNA病毒，属于副黏病毒科，能引起鸡新城疫病。基于NDV对人的弱致病性以及在肿瘤细胞选择性复制的特点，NDV用于肿瘤治疗逐渐得到关注［1］。早期研究主要为静脉或瘤内局部注射NDV及用NDV感染肿瘤细胞制成瘤苗进行免疫治疗。近年来，随着RNA病毒基因工程操作的反向遗传学技术的建立和完善，使人们可以在cDNA水平对病毒基因组进行突变、缺失、颠换、转位和互补等改造，并且可将外源基因插入到NDV基因组中，从而构建重组NDV。目前，NDV作为一种潜在的肿瘤生物治疗因子和新型病毒载体已经广泛的用于肿瘤治疗的基础和临床研究。本文就NDV在肿瘤生物治疗方面的研究及其抗肿瘤机制加以综述。

1 NDV的直接溶瘤作用

1.1 NDV在肿瘤细胞的选择性复制

NDV通过其表面的HN蛋白和宿主细胞表面含唾液酸的受体结合，从而吸附到宿主细胞表面。但是NDV能够利用肿瘤细胞干扰素信号系统的缺陷，从而选择性地在肿瘤细胞中高效复制。人类大多数肿瘤细胞属于干扰素缺陷型的，NDV在这些人类肿瘤细胞中的复制效率比正常细胞高出10 000倍［2］。Fiola C等［3］已阐明了 NDV 在肿瘤细胞选择性复制的机制。NDV复制时，单链RNA复制形成双链RNA，同时诱导细胞中蛋白激酶PKR的高表达，并激活干扰素信号通路，引起抗病毒反应。而在肿瘤细胞中，蛋白激酶会延迟表达，病毒便逃避干扰素信号系统的监控从而大量的复制。NDV特异感染鸡是因为P基因编码的V蛋白可作为干扰素α／β的拮抗剂而破坏鸡细胞中的干扰素信号系统，但在哺乳动物细胞中无此作用［4］。最新研究认为肿瘤细胞产生的抗凋亡蛋白也是NDV选择在其中复制的原因之一［5］。

1.2 NDV的溶瘤机制

不同的NDV株在人肿瘤细胞中的复制效力不同。溶瘤株病毒感染肿瘤细胞后，生成的子代病毒粒子的HN和F基因处于活化状态，新生病毒可继续感染邻近细胞，因而具有较强的细胞毒性［6］。溶瘤株NDV在肿瘤细胞中复制后，剥夺了肿瘤细胞本身的转录和翻译机制，使肿瘤细胞表达受阻，代谢紊乱；另外还可以导致细胞与细胞之间发生融合，产生不能存活的合胞体，从而引起肿瘤细胞的快速、大量死亡。而非溶瘤株病毒产生的新生病毒颗粒无感染性，在肿瘤细胞只进行单次复制，主要通过剥夺宿主细胞的代谢系统而导致细胞慢速死亡。

研究发现，NDV可以直接诱导肿瘤细胞的凋亡。NDV通过活化肿瘤细胞内部线粒体信号途径，降低线粒体膜电位引起细胞色素C的释放，激活caspase－3和caspase－12而直接导致细胞凋亡，是一种p53非依赖的内质网压力介导的凋亡通路［7－8］。有文献报道在肺癌细胞中，caspase和p38MAPK同时参与NDV诱导的细胞凋亡［9］。另一研究发现凋亡因子的过表达也增加了NDV的溶瘤作用［10］。

此外，NDV感染肿瘤患者后，还通过免疫系统引起许多机体抗肿瘤免疫反应，间接地导致肿瘤细胞死亡。

1.3 肿瘤的溶瘤病毒治疗

用NDV（F3aa）－GFP进行的体内外试验表明，这种病毒能够溶解体外培养的头颈癌肿瘤细胞系，并且抑制荷瘤鼠的肿瘤组织［11］。PV701是一株非重组的溶瘤NDV，已完成Ⅰ期临床试验，研究者通过脱敏和缓慢注射的方法增加注射剂量和次数，可以使注射剂量达到24～120×109pfu／m2（plaque forming units），并且可以在2周内连续注射6次。19例结肠癌、卵巢癌、乳腺癌等实体瘤患者中有6例显示了一定的治疗效果，生存期至少延长2年［12－13］。MTH－68／H 被用来直接静脉注入患者体内进行多发性神经胶质瘤的治疗，可以使患者的平均生存率从6个～12个月提高到5年～9年［14］。另一个研究报道了用MTH－68／H和口服丙戊酸联合治疗一名12岁男孩的多发性神经胶质瘤，发现在治疗的开始有相当明显的抑制肿瘤作用，但随后却诱发了丘脑胶质瘤的发生。继续联合使用MTH－68／H和口服丙戊酸使这种诱发的丘脑瘤得到控制，同时还通过免疫组化方法检测到病毒在肿瘤细胞中的复制［15］。2006年一篇有关NDV溶瘤病毒NDVHUJ株Ⅰ／Ⅱ期临床试验的报道，将NDV病毒经静脉注射到恶性胶质瘤患者体内，并从起始0.1BIU～11BIU逐渐增加剂量，最后给予3次55BIU，结果在14列患者中5例有很微弱的发烧症状［16］。以上这些试验说明，一般情况下患者对NDV具有良好的耐受性，NDV基于它对人体的弱致病源性而作为肿瘤的生物抑制剂用于临床。

2 肿瘤的NDV－ATV免疫治疗

2.1 NDV－ATV抗肿瘤的免疫学机制

NDV修饰的自体肿瘤疫苗（NDV modified autologous tumor vaccine，NDV－ATV）是利用 NDV感染从患者肿瘤组织分离的细胞而制成疫苗，手术后再用这种疫苗对肿瘤患者进行主动特异性免疫治疗。NDV－ATV能够通过以下几种方式激活患者体内的抗肿瘤免疫防御系统［6］：①直接诱导肿瘤抑制细胞因子的产生，如干扰素、肿瘤坏死因子、白细胞介素以及单核细胞集落刺激因子等；②激活患者机体内的免疫细胞，如肿瘤特异性T淋巴细胞，加强机体的抗肿瘤作用；③直接产生非特异性的细胞毒作用，增加肿瘤抗原的免疫原性，通过宿主免疫机制杀伤肿瘤细胞。人类肿瘤中只有B细胞淋巴瘤和部分黑色素瘤能够表达共刺激分子，而其他大部分肿瘤因不能表达共刺激分子造成机体免疫耐受。但是接种NDV－ATV后，NDV的HN基因能够在肿瘤细胞和抗原递呈细胞表面表达，并与这些细胞表面的相应受体结合，诱导T细胞共刺激活性，激活肿瘤特异性T淋巴细胞。

2.2 NDV－ATV免疫治疗的研究与应用

早期对溶瘤病毒的利用是在手术后用NDVATV对患者进行主动特异性免疫的辅助治疗。这种辅助治疗明显增加患者的免疫力和存活时间，而且负面效应很小。Cassel WA等人在1992年报道了NDV溶瘤剂使用后，所有恶性黑素瘤病人手术后的存活期均超过10年，而且有60%的病人肿瘤不再复发，比以前报道的33%提高了很多。用NDV修饰的自体肿瘤疫苗联合低剂量的细胞因子对208个重度肾癌病人进行手术后的辅助治疗，使病人手术后的存活率平均提高到21个月，疫苗使用后肿瘤的复发率降低到9%。最近，德国Schirrmacher V实验室用NDV－ATV治疗头颈鳞癌的研究已经取得了很大的进展，手术后使用NDV－ATV的Ⅲ、Ⅳ期肿瘤患者的5年存活率提高到61%，而且用NDV－ATV注射后病人体内的抗肿瘤反应T细胞可持续5年～7年。并认为NDV－ATV主要通过激活机体内在的免疫反应以及抗肿瘤记忆性T细胞的CD4和CD8来抑制治疗后残留肿瘤细胞的恶性发展，抑制肿瘤的复发，延长病人的存活时间［17］。

3 NDV为载体的肿瘤基因治疗

3.1 NDV作为病毒载体的特点

基因治疗被认为是人类征服癌症的潜在有效手段。肿瘤细胞复制型病毒载体即溶瘤病毒载体是新近发展起来的新型基因治疗运载系统。这种病毒载体能够通过本身的复制扩增所携带治疗基因的表达水平，另外这种复制还可以直接影响宿主细胞的翻译和转录过程而导致肿瘤细胞的坏死或凋亡，继而肿瘤相关抗原的释放会引起溶瘤后的机体抗肿瘤免疫反应。因此以溶瘤病毒为载体的基因治疗兼具溶瘤作用、外源性治疗基因和抗肿瘤免疫反应的综合杀伤效果。

NDV作为新型溶瘤病毒载体具有以下优点：①NDV属于禽类病毒，对人类无致病性；②NDV为负链RNA病毒，不会和宿主细胞基因组发生整合，保证了宿主的遗传稳定性；③NDV天然的肿瘤细胞靶向复制，使其能够在大多数人类肿瘤细胞中高效复制而杀死肿瘤细胞［1］；④NDV和肿瘤细胞结合后，能够激活机体本身的免疫防御系统和肿瘤特异性T淋巴细胞，加强机体抗肿瘤免疫反应的能力［18］；⑤利用反向遗传学操作可以很容易地将外源性基因插入到NDV基因组中。

3.2 NDV的肿瘤基因治疗研究

NDV作为基因治疗载体正处于实验室研究阶段，目前的主要任务集中在通过基因工程构建重组NDV，使其具有肿瘤靶向性。有研究表明NDV的HN基因上特定氨基酸残基的不同是决定病毒抗原表位的一个因素［19］。Bian H 等［20－21］构建了双特异性 融 合 蛋 白 anti－HN／IL－2，其 一 端 为 抗 HN 的scFv，另一端为人IL－2。试验 表明，anti－HN／IL－2能将重组NDV－EGFP募集到IL－2受体阳性的淋巴瘤细胞中进行复制，增加了NDV的肿瘤靶向性，从而有效地杀死肿瘤细胞。将抗CD3和CD28的双特异抗体偶联到NDV上，用这种修饰的病毒作为载体进行肿瘤的病毒治疗，可以启动人类淋巴细胞中强烈而持久的抗肿瘤效应，增加了肿瘤的治疗效果［22］。

3.3 NDV的安全性

NDV除了具有上述优点外，因其RNA病毒的性质以及溶瘤特点，使它在临床试验和应用上也显示出一定的安全性。Schirrmacher V等［23］用NDVUlster感染人类肿瘤细胞制成NDV－STV肿瘤疫苗，并证明这种疫苗仅在注射位点的肿瘤局部进行复制，没有形成全身扩散，不会影响宿主的基因组结构，也不会在正常细胞中复制，对人类没有感染性。PV701和 MTH－68／H的临床应用也证明了NDV在最大剂量范围内很少引起严重的不良反应，仅仅出现的轻微发热、过敏等症状基本上可以自愈［12－14］。NDV溶瘤病毒NDV－HUJ株用于多型性恶性胶质瘤治疗的Ⅰ／Ⅱ期临床试验也证明了其临床安全性，仅有30%的病人出现反应性发烧症状［16］。正是因为NDV在肿瘤治疗中的独特优点和潜在的安全性，才使这种病毒在临床上的试验越来越广泛。

4 展望

随着分子病毒学研究的深入，用复制型病毒代替非复制型病毒作为载体成为近年来基因治疗的新方向，由于这类载体在感染靶细胞后，新生病毒粒子可继续感染邻近细胞，因而扩增了外源基因转染，有助于提高疗效。NDV是一种天然的复制型溶瘤病毒载体，而且通过反向遗传学使NDV携带外源基因的技术已经相当成熟，加上这种病毒在人体内无致病性，操作起来比较安全，因此NDV是一种理想的用于肿瘤治疗的溶瘤病毒基因治疗载体。

虽然NDV作为病毒载体有以上诸多优点，但也不可避免地存在一些缺点：①具有广谱的细胞亲嗜性。NDV虽可在肿瘤细胞中选择性复制，但其HN蛋白也能够和正常细胞表面含唾液酸的糖蛋白亲和而吸附在细胞表面，引起正常细胞的毒性作用，并且使最终结合靶肿瘤细胞的病毒剂量减少；②引起机体的溶血作用。Bian H等研究发现NDV与小鼠或人红细胞结合，能导致红细胞凝集和溶血作用［20－21］；③激活机体的免疫防御系统。病毒感染引起的机体免疫反应对后来病毒感染的抵制作用，阻碍了病毒溶瘤作用的反复性和彻底性。此外，病毒感染时形成的抗原－抗体复合物，还可能引起免疫变态反应。因此NDV肿瘤治疗研究需要解决两个问题：①减小机体免疫防御系统对病毒在肿瘤内复制和扩散的影响；②赋予病毒靶向性，使病毒特异地和肿瘤细胞结合，而减少对正常细胞的毒性作用。

目前，NDV携带的外源性基因仅局限于报告基因和病毒蛋白，未见有携带治疗基因的报道。因此，构建具有功能性治疗基因并具有肿瘤靶向性的重组病毒载体是未来NDV基因治疗的发展方向。另外，Li Y L等［24］研究证明了NDV在活化的肝星状细胞中也能高效复制，这个发现也为拓展NDV生物治疗的范围提供的理论基础。

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