Vero细胞无血清培养基研究进展＊

苏晓蕊，岳 华，汤 承

（西南民族大学生命科学与技术学院，动物医学四川省高等学校重点实验室，四川 成都 610041）

目前，大规模的动物细胞培养已被广泛应用于生物制品的生产和加工，这些产品主要用于疾病的诊断和治疗。不同的细胞系对培养条件有特殊的要求，尤其是对培养基的成分。目前常用的培养基为基础培养基添加一定浓度的动物血清或其他动物（人）源成分来维持细胞的生长和繁殖。血清是体外细胞培养用得最多最广的天然培养基，具有十分重要的作用，它能为细胞提供生存、生长和增殖所必需的生长因子、细胞贴壁和铺展的基质成分、载体蛋白、中和毒性的物质、为培养液提供很好的缓冲体系及蛋白酶抑制剂等[1]。但是从培养基的安全性和稳定性考虑，传统的培养基还是有一些缺陷。由于血清所含的化学成分不确定，每个批次之间也存在着差异，同时血清的价格昂贵，还容易引起细菌、真菌、病毒和支原体污染[2]。此外，血清中大量成分复杂的蛋白质会给疫苗、细胞因子和单克隆抗体等生物制品的分离纯化带来很大的困难，而且这些蛋白质在生物制品的说明书中还要标明[3]。所以，无血清和无动物源成分的培养基是生物制品发展的必然方向。

无血清培养基是不含血清，但含有动物源成分的培养基。无动物源成分的培养基是不含任何动物源成分的培养基，它们的化学成分明确、质量均一且蛋白质含量低，有利于提高细胞产品生产的稳定性，并减少了后期纯化工艺。生产过程中还可以通过无血清培养基成分的优化，使不同的细胞能各自在最有利于其生长或最有利于表达的目的产物的环境中持续高密度培养。Vero细胞是世界卫生组织和我国生物制品规程认可的生产疫苗的细胞系。与用作疫苗生产的其他细胞基质相比，Vero细胞的来源方便，生物安全性高，对多种病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高，是很多病毒理想的基质，能广泛的用于人和动物疫苗的生产[4－8]。鉴于以上原因，Vero细胞的无血清培养是现代生物技术的一个重要研究领域，无血清培养的技术关键在于培养基的设计和优化。本文对Vero细胞的无血清培养基的研究进展做一综述。

1 Vero细胞无血清培养基的组成

无血清培养基由基础培养基和添加因子两大部分组成。不同的基础培养基中，添加因子的种类和浓度是不同的，具体试验过程中要根据需要优化。

1.1 基础培养基

基础培养基中最重要的营养成分是葡萄糖和谷氨酰胺。葡萄糖是细胞生长增殖以及产物表达过程中重要的能量来源。谷氨酰胺是最初的氮源，同时也是碳和能量来源，它还为细胞提供蛋白质和氨基酸的胞内前体物质，细胞所需能量的30%～65%都来自于谷氨酰胺的代谢[9]。但是过高浓度的葡萄糖和谷氨酰胺会引起培养基中乳酸及氨等代谢产物的堆积而损害细胞。Petiot E等[10]通过对Vero细胞在无血清培养过程中的中心代谢研究，证明了葡萄糖主要参与糖代谢，谷氨酰胺是三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）最主要的碳源，天冬酰胺和丙酮酸钠可以代替谷氨酰胺作为碳源，从而减少乳酸盐和氨气等次级代谢产物对细胞的危害。谷氨酰胺容易降解，在新配制的培养基中要重新添加与基础培养基中相同的量。

目前，Vero细胞常用的基础培养基有 M199、DMEM和F12。陈昭烈等[11]以 DMEM∶F12（1∶1）为基础培养基，研制出一种用于Vero细胞微载体培养的无动物来源成分无血清培养基专利，这种培养基无论是在细胞形态还是细胞的活力方面都能达到含100mL／L血清培养基的效果；Rourou S等[12]利用 M199作为基础培养基研制出一种Vero细胞无动物源成分的培养基，细胞在这种培养基下经过10次传代后，生长速率和分裂指数都能达到含血清培养基的效果。不同的基础培养基含的营养成分不同，所以选择添加因子和优化添加因子的浓度就成为了无血清培养基研制的重要环节。

1.2 主要添加因子

添加因子是无血清培养基中血清替代成分的总称，它们的种类繁多，主要包括生物大分子、小分子化学物质和微量元素。根据它们在细胞培养中的作用可以分为4类。

1.2.1 蛋白质类 在Vero细胞无血清培养的研究初期，主要是采用添加牛（人）血清白蛋白和转铁蛋白来达到促进细胞生长的目的。血清白蛋白不但有调节渗透压，保护细胞免受机械损伤的作用，它还能通过与维生素、脂类、激素、金属离子和生长因子的结合，从而稳定和调节这些物质在无血清培养中的活性。此外，它还有结合毒素和减轻蛋白酶对细胞影响的作用。新的研究发现，现在Vero细胞的无血清培养选用植物水解蛋白替代血清白蛋白，这种蛋白质成分复杂，主要包括氨基酸、寡肽类、紫锥菊多酚和纤维[13]。目前最常用的植物水解蛋白有大豆植物水解蛋白，小麦植物水解蛋白和水稻植物水解蛋白[14]。这些植物来源的蛋白质，使疫苗的生产过程更安全。转铁蛋白是细胞无血清培养最重要的添加成分，它的缺失可能导致细胞生长的抑制。另外，它还是一些有害微量元素的螯合剂。有资料显示转铁蛋白可以被某些铁螯合剂所代替，常用的螯合剂为Fe3＋－硫酸酯－亚氨基二乙酸（Fe3＋－sulfateiminodiacetic acid，IDA）复合物、Fe3＋－硫酸酯－甘氨酰甘氨酸（Fe3＋－sulfate－glycylglycine，gly－gly）复合物。与IDA相比，gly－gly结合铁的能力较低，因而它的应用受到一定的限制。Rourou S等[12]2009年在研究Vero细胞无动物源成分培养基时认为柠檬酸铁和维生素C混合使用可以替代转铁蛋白，使用浓度为100μmol／L。Zhang J[15]在 NSO细胞的无血清培养中成功的运用托酚酮和柠檬酸铁铵代替转铁蛋白。Landauer K等[16]的研究表明，在工业化生长条件下，培养CHO细胞时，柠檬酸铁的浓度在缺少调和生长因子的无蛋白培养基中对提高细胞的黏附至关重要。这些研究成果为我们寻求转铁蛋白替代品提供了参考。

1.2.2 激素和生长因子 胰岛素是多种细胞生长所需的关键成分，它能够刺激尿苷和葡萄糖摄取，促进RNA、蛋白质和脂类的合成，增加脂肪酸和糖原的浓度[17]，在很多的低血清和无血清细胞培养基中都要添加。但是Rourou S等[12]认为胰岛素在Vero细胞的无血清培养基中可以去除，这种报道目前来看有待进一步的研究。

此外，Vero细胞的生长还需要一定量的其他激素，如多肽类激素中的生长素、胰高血糖素、甲状腺素等以及甾类激素中的孕酮、氢化可的松和雌二醇等。在Vero细胞的无血清培养过程中，研究者常常加入皮质醇等激素来优化培养基成分。

生长因子是维持细胞体外生存、增殖和分化所必须的补充因子。它是有效的促有丝分裂原，能缩短细胞群体的倍增时间。在Vero细胞的无血清培养中，常用的细胞生长因子是EGF和FGF。Clark JM等[18]在研究微载体无血清动物细胞培养时认为EGF更能够促进Vero细胞的生长，使细胞产量增加10%～15%，浓度为100μg／L，这与 Rourou S等[12]报道的结果一致。但是，一些报道认为FGF在Vero细胞无血清培养中作用更重要。但是现有的研究成果显示，EGF的使用频率远远高于FGF。

1.2.3 促贴壁因子 绝大多数的真核细胞都是贴壁依赖性细胞，这就要求无血清培养基中添加促贴壁因子。常规的贴壁细胞培养依赖的是血清中含的纤连蛋白、胶原蛋白和多聚赖氨酸等成分，这些因子除具有促进细胞贴壁延伸的作用外，还能促进细胞的分化。目前常用化合物来代替血清中的促贴壁成分，如明胶、teleostean等。在 Rourou S等[12]研究中，在没有添加促贴壁因子时，细胞聚集成团，分布不均匀。而在培养瓶上包被一层teleostean，则细胞贴壁良好，分裂指数也与适应100mL／L血清培养的Vero细胞差别不显著。这表明，在贴壁细胞的无血清培养研制中，选择合适的促贴壁因子促进细胞的贴壁和生长是很重要的。

1.2.4 微量元素 在Vero细胞无血清培养基中常添加的微量元素是亚硒酸钠，另外常添加的微量元素还有锌。硒是宿主免疫应答和抗氧化过程中非常重要的微量元素，它以硒代半胱氨酸的形式参与谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物歧化酶的作用过程，消除氧化物酶和氧自由基对细胞的伤害。Verma S等[19]在2008年研究体外培养硒的缺乏对西尼罗病毒的增殖和致细胞病变的影响时报道，硒的缺乏能够影响细胞活力、谷胱甘肽过氧化酶的表达和增加西尼罗河病毒感染后的细胞病变，但这并不能说硒是通过限制氧化应激平衡细胞生死的重要元素。有报道称硒还能防止细胞的光照损伤。亚硒酸钠的最适添加浓度是20nmol／L～50nmol／L。细胞无血清培养还要解决由于血清的缺乏而导致的细胞凋亡，Zn离子和金精三羧酸（aurintricarboxylic acid，ATA）有抑制细胞凋亡的作用，因此在Vero细胞无血清培养基中也要添加。

1.2.5 维生素 维生素是维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用。在Vero细胞无血清培养基中常添加维生素C、维生素E和生物素。维生素C和维生素E具有抗氧化作用；生物素是一些特异羧化酶的组成部分，参与糖代谢和脂肪酸的合成过程。

1.2.6 其他添加因子 在现有的关于Vero细胞无血清培养基的报道中，几乎都添加了乙醇胺，它作为一种还原剂，可以稳定细胞膜[12]。另外，也有的在培养基中添加丙酮酸钠和β－巯基乙醇。丙酮酸钠是碳水化合物代谢的中间产物，可以为细胞增加营养物质[10]。β－巯基乙醇可以改善细胞的存活率[20]。

2 展望

随着现代细胞工程的发展，利用无血清培养基培养Vero细胞作为基质生产疫苗的应用越来越广泛。市场上商品化的Vero细胞无血清培养基主要是无血清培养基和无血清无动物源成分的培养基。无血清培养基尽管能够维持细胞在体外的生长和增殖，但仍存在外来污染的可能，使疫苗安全性存在潜在的风险。因此，适合Vero细胞生长的无血清无动物源成分的培养基是目前常用的培养基。这些培养基利用植物或酵母水解蛋白和重组蛋白替代动物源蛋白质，有效地提高了疫苗的安全性；也可以用氨基酸或多肽片段代替蛋白质。但是一些添加因子的价格昂贵，与含血清培养基相比增加了成本。因此，如何降低生产成本，是Vero细胞无血清培养基今后的一个重要研究方向。此外，由于生物反应器微载体培养以及发酵罐悬浮培养能够实现Vero细胞的大规模培养，增加细胞的浓度，提高病毒的产量，所以适应这两种培养技术的无血清培养基是今后一段时期细胞工程产品生产和研制的重要发展目标，并且在病毒疫苗的生产上有了一定的应用[21－24]。

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