纤维素酶基因克隆与表达

卢 敏 王帅豪 狄元冉 袁 林 尹清强

(河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002)

纤维素是自然界中最丰富的天然有机物，占植物界碳含量的50%以上，堪称为世界上总量最大的可再生资源。地球每年都会产生大量的植物纤维素，我国仅农作物秸秆年产量就高达6×108～7×108t，但这些宝贵的纤维素资源并没有被有效地利用，只有少部分用于造纸、纺织或用作粗饲料、薪柴等，大部分以堆积、荒烧等形式直接倾入环境，造成极大的污染和浪费［1］。合理地开发与利用纤维素资源对人类生存环境和可持续发展有着举足轻重的影响。

利用微生物及其产生的纤维素酶(cellulase)来分解纤维素是一种有效且无污染的方法。纤维素酶是降解纤维素的高活性生物催化剂，广泛用于饲料、环保、食品、酿酒、纺织、造纸等领域，但纤维素酶的工业化生产受到酶效率低、热稳定性差以及成本较高等诸多因素的限制。随着生物技术的发展，利用基因工程手段开发高活性、高产量的纤维素酶资源越来越受到国内外学者的重视。目前，纤维素酶基因的克隆及表达已经取得了很大的进展，本文旨在对纤维素酶基因工程研究的进展、发展前景进行简要的综述。

1 纤维素酶的组成

纤维素酶是将纤维素水解成纤维二糖和葡萄糖的一组复杂酶系的总称，细菌、真菌、放线菌等微生物都能产纤维素酶。细菌纤维素酶不能分泌到胞外，而且产量少、酶系单一、活性低。真菌则能产生大量的胞外纤维素酶，酶系较完全，产纤维素酶的真菌来源十分广泛，如木霉属、曲霉属和青霉属等。其中木霉不产生毒素，而且产酶效率高、活性高、酶性稳定，是目前应用最广的纤维素酶生产菌［2］。

纤维素酶并不是一种单一组分的酶，而是由许多高协同作用的水解酶组成的复合酶体系，根据其催化反应功能的不同可分为:1)内切葡聚糖酶［内切 － 1，4-β-D － 葡聚糖酶(endo-1，4-β-D-glucanase)，EC 3.2.1.4］，来自真菌的简称为 EG，来自细菌的简称为Cen，又称Cx、CMC;2)外切葡聚糖酶［外切 －1，4-β-D － 葡聚糖酶(exo-1，4-β-D-glucanase)，EC 3.2.1.91］，来自真菌的简称为CBH，来自细菌的简称为Cex，又称C1、微晶纤维素酶;3)β－葡萄糖苷酶［β-1，4－葡萄糖苷酶(β-1，4-glucosidase)，EC 3.2.1.21，BG］，又称纤维二糖酶。纤维素的完全水解，是这3种酶的协同作用，内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区，产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端，释放葡萄糖或纤维二糖。β－葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生2分子的葡萄糖［3］。

2 纤维素酶的分子结构

对纤维素酶分子结构的认识开始于1986年，Tilbeurgh等［4］用木瓜蛋白酶对瑞氏木霉(Trichoderma reesei，又译作里氏木霉)的CBHⅠ分子进行限制性酶切，得到2个具有独立活性的结构域:具有催化功能的催化域(catalytic domain，CD)和具有结合纤维素功能的纤维素结合域(cellulose binding domain，CBD)。之后用类似的方法在多种细菌和真菌的纤维素酶中发现类似的结构，CBD在纤维素酶中位于氨基端或羧基端，它通过1段高度糖基化的连接桥(linker)与CD相连。CBD使纤维素酶结合于纤维素表面，使得临近的CD易于接近底物，促进底物的水解。Linder等［5］的研究表明，纤维素酶去除CBD后对可溶性底物活性影响较小，而对结晶纤维素的吸附和水解活性则有明显降低。CBD的存在对于外切葡聚糖酶的识别底物及催化尤为重要［6］。只有少数微生物和高等植物产生的纤维素酶不具有这类结构域，如厌氧性的热纤梭菌(Clostridium themocellum)的纤维素酶［7］，是依靠纤维小体吸附于纤维底物上的。CD是纤维素酶的催化活性中心，纤维素内切酶和外切酶的底物特异性可以由CD的三维结构进行合理的解释［8］:内切酶的活性位点位于1个开放的裂口(cleft)中，它可结合于纤维素链的任何部位并切断纤维素链;外切酶的活性位点位于1个环(loop)所形成的通道(tunnel)里面，它只能从纤维素链的非还原性末端切下纤维二糖。连桥是1段富含脯氨酸和羟脯氨酸的连接肽，它的作用可能是保持CD和CBD之间的距离，有助于同酶分子间形成较为稳定的聚集体［9］。

3 纤维素酶基因的克隆

天然纤维素酶由于酶活较低以及生产成本较高等因素的限制，大规模的工业化应用有一定的困难，对纤维素酶基因进行克隆，构建高效纤维素酶产生菌越来越受到人们的重视，同时也为纤维素酶的大规模生产提供了新的途径。随着分子生物学的不断发展，人们在纤维素酶基因克隆方面进行了卓有成效的研究。自1982年Whittle等［10］首次报道纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)的纤维素酶基因被克隆以来，人们不断从细菌与真菌中发现和分离出纤维素酶系，大量纤维素酶的基因得到克隆和表达，极大地丰富了纤维素酶的研究材料。目前已有数千种纤维素酶基因序列和相应的氨基酸序列被公布在GenBank、欧洲分子生物学实验室(EMBL)核苷序列数据库、日本DNA数据库(DDBJ)等共享数据库中。由于木霉属产纤维素酶有产酶效率高、酶系全、活性高、较为稳定等诸多优点，对木霉属基因的研究最多，外切酶基因CBHⅠ、CBHⅡ，内切酶基因 EGⅠ、EGⅡ、EGⅢ、EGⅣ、EGⅥ，葡萄糖苷酶基因BGⅠ、BGⅡ等都已经被克隆，并且转化至大肠杆菌进行了表达。祝令香等［11］克隆并测定了康宁木霉K801纤维素酶CB HⅠ基因序列，发现与瑞氏木霉已知序列的同源性达到99.89%。肖志壮等［12］利用PCR方法从瑞氏木霉cDNA文库中扩增出全长内切葡聚糖酶EGⅢ基因并克隆到酿酒酵母非整合型表达载体pAJ401上，转化到酿酒酵母中表达出具有活性的EGⅢ蛋白。石贤爱等［13］从长梗木霉中PCR扩增获得BGLⅡ、CBHⅡ和EGⅠ基因，这3种纤维素酶基因与GenBank上其他木霉同种纤维素酶基因具有较高同源性，对上述纤维素酶基因编码的相应蛋白进行结构序列检索(PROSITE motif search)，对其N端糖基化位点、纤维素结合区、糖基水解酶家族特征结构区等进行了定位。林玲等［14］扩增得到瑞氏木霉纤维素酶的编码基因EGLⅡ，连接到 pET-28a载体上，转化到 E.coli BL21(DE3)宿主菌中，并进行了蛋白表达的检测。

4 纤维素酶基因的原核表达

随着基因工程技术的发展，几乎所有已克隆的纤维素酶基因都在大肠杆菌中进行了表达。黄艳等［15］从康氏木霉中克隆得到纤维素酶EGⅠ基因，重组到T7启动子控制下的表达载体pET-His中，转入大肠杆菌，十二烷基四乙酸二钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测到重组产物分子质量约为45 ku，在大肠杆菌中成功表达，并对重组酶的粗酶液进行了酶学性质的初步研究。王万能［16］利用反转录PCR方法技术，从福寿螺中克隆纤维素酶基因 CelAg，并构建于表达载体 pET-30a(+)上，再转化至大肠杆菌BL21(DE3)，重组菌发酵后测得纤维素酶活可达8.31 U/mL。任慧杰等［17］采用PCR技术克隆了松材线虫纤维素酶的编码基因BXC46，将其克隆到表达载体pET-15b上，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，检测到部分纯化的重组蛋白具有纤维素酶的活性，其最适温度为45℃，最适pH为4.0。

由于大肠杆菌的分泌表达水平很低，而且产生的纤维素酶大部分不能分泌到胞外，提取有很大的困难，无法达到纤维素酶生产的要求。为了得到胞外分泌物，一些纤维素酶基因已经成功在枯草芽孢杆菌、乳酸发酵短杆菌和变青链霉菌等中得到了有效表达［18］。赵莹等［19］成功地构建了可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-CBHⅡ，将pW425t2-CBHⅡ转化至大肠杆菌胸腺嘧啶合成酶(thyA)基因缺陷型的乳酸杆菌感受态细胞中，测得重组菌CBHⅡ的酶活达到0.115 6 U/mL，反应最适温度和pH分别为50℃和5.0。李方正［20］克隆了1株枯草芽孢杆菌EG基因序列，测得该基因序列全长1 518 bp，构建重组乳球菌表达质粒pMG36e-EG，电转化至乳球菌MG1614感受态细胞，成功构建了产内切纤维素酶的基因工程乳酸菌。

5 纤维素酶基因的真核表达

5.1 纤维素酶基因在酵母中的表达

纤维素酶基因在异源宿主中的表达要遇到蛋白水解酶和糖基化等问题，这使得酵母菌成为表达的首选菌，它不仅可以对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，使表达出的蛋白具有生物活性，而且酵母本身分泌的蛋白成分很少，利于表达蛋白的分离纯化，是目前较为理想的真核表达系统;此外，酵母菌繁殖速度快、营养要求低、培养基价格低廉、便于工业化生产［21］。张煜等［22］采用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统进行了瑞氏木霉CBHⅡ基因的表达。母敬郁等［23］从褐色热单孢菌(Thermomonospora fusca)中PCR扩增纤维素酶Cel6A基因，克隆到表达载体pGAPZαA上，转化至毕赤酵母X-33并成功表达，用羧甲基纤维素法测得发酵上清液中酶活为500 U/mg，用滤纸法测得酶活为1 U/mg。王利英等［24］反转录得到葡聚糖内切酶EGⅠ和EGⅢ基因的cDNA，将其克隆到酵母载体中，成功构建了产生纤维素酶的酿酒酵母工程菌。刘海英等［25］将长梗木霉SSL的EGⅠ基因表达于毕赤酵母，经甲醇诱导后，胞外重组EGⅠ的酶活达73 U/mL。田生礼等［26］应用 PCR技术从嗜碱性芽孢杆菌ATCC21833中扩增碱性纤维素酶基因，克隆至酵母整合型表达载体pGAPZaA中，并转化至巴氏毕赤酵母GS115，成功构建了表达碱性纤维素酶的毕赤酵母工程菌。黄时海等［27］克隆了康氏木霉CBHⅠ基因，并在毕赤酵母中成功表达，表达产物酶活达到24.1 U/L。

纤维素的降解是纤维素酶系协同作用的结果，在酵母中表达多个纤维素酶，则可以得到直接降解纤维素的酵母工程菌。已有研究表明多个纤维素酶基因共转化酵母，其表达产物酶活有一定的提高，而且对纤维素也具有更好的降解作用。丁新丽等［28］构建了同时表达CBHⅠ和EGⅠ基因的重组酵母菌株，滤纸酶活比单独表达EGⅠ基因的重组菌株提高14.3%。龚映雪等［29］从绿色木霉中获得纤维素酶基因EGⅢ和CBHⅡ，以pScIKP为载体，将EGⅢ和CBHⅡ基因共转化酿酒酵母，获得重组酵母菌株S.cerevisiae-EC。该重组酵母能降解羧甲基纤维素形成水解圈，且2种酶具有协同作用，能更有效降解非结晶纤维素。

5.2 纤维素酶基因在真菌及植物中表达

丝状真菌自身就是纤维素酶合成的重要菌种，同时也是优良的外源基因表达系统，如瑞氏木霉外源基因表达系统中的CBHⅠ基因是强启动子［30］，可以有效地表达外源基因。汪天虹等［31］采用PCR技术体外扩增获得了瑞氏木霉CBHⅠ基因启动子和终止子序列。并以大肠杆菌质粒pUC19为骨架，在该启动子和终止子序列间加入多克隆位点，构建了瑞氏木霉强表达整合型载体pTRIL。石矛［32］将强启动子 PKIα 与绿色木霉CBHⅡ基因序列连接，成功构建了重组表达质粒pUT-CE，并用电穿孔法转化回原宿主菌绿色木霉，纤维素酶工程菌培养72 h，总酶活达到45 U/(mL·h)，Cx酶活达到1 600 U/(mL·h)，C1酶活达到160 U/(mL·d)，葡萄糖苷酶活达到15 U/(mL·h)。胡耀辉等［33］以瑞氏木霉 PcbhⅡ为启动子，pCAMBIA1302为载体，成功构建了CBHⅡ基因过量表达的绿色木霉工程菌。此外，杨培周等［34］构建了毛柄金钱菌gpd启动子驱动的福寿螺纤维素酶基因(mfc)的真核表达载体，并将基因整合入灰盖鬼伞基因组中，得到的工程菌酶酶活最高达到:滤纸酶活21.5 U/mL、CMC酶活44 U/mL，分别是对照组的1.79 和 1.6 倍。

采用基因工程手段将编码纤维素酶的基因导入植物中，使植物大量合成纤维素酶，将纤维素转化为单糖，这样就能大大提高纤维素的消化率与吸收率［35］。另外，以作物为原料表达纤维素酶在生物乙醇生产中也具有极大的潜能，在转基因植物内生产纤维素酶比在微生物中要廉价的多，这是以植物为载体生产纤维素酶的最大优势［36］。吕明等［37］以 pAHC17、pCD29A 质粒为基础，分别构建了Ubi启动子调控的纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与rd29A启动子调控的DREB1A基因的双价植物表达载体pBDB、pBDC，并将重组质粒导入到根癌农杆菌 LBA4404中。胡一飞［36］利用PCR方法从瑞氏木霉克隆得到 EGⅤ、EGⅣ、CBHⅠ基因，采用农杆菌介导的方法将EGⅤ基因转化到水稻中，通过免疫印迹(Western blot)杂交检测到转基因株系的T0代干枯秸秆和T1代鲜活叶片中瑞氏木霉EGⅤ基因得到了表达，有一定的蛋白产物，并且在室温储藏了3个月的T0代秸秆中稳定存在。蒋西然［38］利用褐色高温单孢菌的耐高温内切纤维素酶(E2)和外切纤维素酶(E3)构建了7种植物表达载体，实现了将外源纤维素酶在烟草细胞的质外体、内质网和细胞质基质的定位表达。利用农杆菌介导法将表达载体导入烟草，PCR检测表明纤维素酶基因在烟草中成功转录。

6 小结

纤维素酶基因的克隆与表达已经取得了很大的进展，但表达、分泌均较弱，并没在真正意义上得到高效分解纤维素的工程菌，不能大规模的应用于生产。纤维素酶基因酵母表达系统的构建仍是研究的热点，选择性的将多个纤维素酶基因在酵母中共表达，是今后研究的一个重要方向。木霉具有十分成熟的批量发酵技术，还有较强的蛋白质胞外分泌能力，随着木霉表达系统的不断成熟，纤维素酶基因在木霉中表达的研究将会越来越多。总之，通过对纤维素酶基因工程的研究，纤维素酶应用于工农业生产的进程也在加快，相信随着生物技术的不断发展，纤维素酶基因工程的研究也会不断地完善，更多的纤维素酶基因将被克隆及表达，纤维素酶基因工程菌将会真正的应用于生产。

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