聚乙二醇胁迫杂交桑品种桂优62丛生芽部分生化指标的变化

余亚圣 黎其友 赵爱春 金筱耘 李晔 余茂德

（西南大学生物技术学院，重庆 400716）

桑树是多年生木本植物，抗逆性能较强，即使在极度干旱的沙漠边缘和冰凌冷寒的北疆地带都可以见到桑树[1]。因此，随着蚕桑产业的发展，科学研究的推进，桑树不再只是养蚕的饲料来源，桑树多元化特别是作为生态树种具有广阔的前景，也是科技工作者关注的焦点[2]。但是桑树种质资源丰富，品种之间的抗逆性能有显著差异。研究表明，木本植物在受到水分胁迫时，可溶性糖和脯氨酸含量有所增加，活性氧自由基积累导致膜脂过氧化，植物细胞的结构受到影响，细胞质膜相对透性增加，体内氧化物质增加，从而会导致细胞膜发生过氧化。许多树种相关研究显示，质膜透性与细胞膜过氧化产物丙二醛（MDA）含量的高低与细胞膜的伤害程度一定程度上呈正相关关系[3]，因此，可溶性糖、脯氨酸和丙二醛常常作为鉴定木本植物抗旱性的部分生化指标。聚乙二醇（polyethvlene glycol，PEG）是一种高分子渗透调节剂，能够夺取水分对植物造成渗透胁迫，利用它的渗透调节能力处理外植体，提高种子活力及抗逆性是近年来水分胁迫研究的内容之一[4－6]。本实验室桑树胚轴、子叶离体再生体系已经建立，桂优62桑树是商品化的优良杂交品种，发芽早，产叶量高，因此本实验在培养基中添加PEG模拟水分胁迫，测定组培苗的可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量的变化，桑树杂交品种的抗水分胁迫能力提供参考，也为筛选桑品种水分胁迫提供一条新途径。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

桂优62号桑种（购自广西蚕业技术推广总站）。配制5个浓度分别为1%、3%、5%、7%、10%PEG溶液。

1.2 试验设计

种子用双蒸水预培养24h，然后用0.1%的升汞消毒2～3min，接着用75%的酒精消毒20 s，最后用双蒸水冲洗3～5次，在超净工作台上将上述种子分装到已灭菌的PEG溶液中，并以双蒸水作为对照，每瓶100粒种子，最后将4个培养瓶放入摇床进行培养（28℃，100r/min）。将1%、3%、5%、7%、10%的PEG溶液灭菌以后在超净工作台中加入MS诱导培养基中，待桑种长出胚轴后，剥出子叶、胚轴接种。培养条件参照王茜龄等[7]，诱导出的丛生芽备用。

1.3 可溶性糖含量的测定

采用苯酚法[8]测定可溶性糖含量，标准曲线方法略。取丛生芽0.3g，加5mL蒸馏水研磨成匀浆，倒入试管中，用塑料膜封口，于沸水中浸提30min（提取两次）提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。吸取0.5mL样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，向试管内加入1mL9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以5～20s加入5mL浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8mL，在室温下放置30min，然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定吸光度，由标准曲线得出糖的含量。

于485nm波长处测定吸光度。以下公式计算可溶性糖含量：

其中：C—标准曲线得出糖的含量（μg）；VT—提取液体积（mL）；VS—测定时取用样品体积（mL）；N—稀释倍数；W—样品质量（g）。

1.4 脯氨酸含量的测定

采用磺基水杨酸浸提植物脯氨酸，酸性茚三酮显色处理，于室温下用二甲苯萃取显色物质，取上清，520nm波长下比色，利用以下公式计算脯氨酸含量：

其中：C—标准曲线得出脯氨酸含量（μg）；V—提取液总体积（mL）；a—测定时所吸取的体积（mL）；W—样品质量（g）。

1.5 丙二醛（MDA）含量的测定

参照文献[9]的巴比妥酸显色法，用三氯乙酸提取MDA，2－硫代巴比妥酸显色，分别于532nm，600nm，450nm处测定吸光度。利用公式C（μmol/L）＝6.45（A532－A600）－0.56A450消除由蔗糖引起的误差。其中：A450、A532和A600分别表示450nm、532nm和600nm处的吸光度值。再利用以下公式计算含量：

2 结果与分析

2.1 丛生芽的生长

桑丛生芽在含有不同PEG浓度的MS培养基中生长情况有很大的差异（附图1）。PEG浓度为1%时，组培苗生长基本正常；随着PEG浓度升高，组培苗开始出现黄化叶片；当PEG浓度达到7%时，可以明显看出PEG胁迫处理的组培苗比对照桑苗矮小，大多数叶片变黄；当PEG浓度增加到10%时，组培苗全部干枯死亡。

2.2 PEG胁迫对幼苗生理生化指标的影响

2.2.1 PEG胁迫对幼苗可溶性糖含量的影响

（1）可溶性糖标准曲线

图1 可溶性糖标准曲线

（2）样品中可溶性糖含量的变化

图2 不同PEG浓度对丛生芽可溶性糖的影响

由以上图表可得，在丛生芽的筛选过程中，随着PEG浓度的增加，可溶性糖含量下降。PEG浓度1%、3%、5%下的可溶性糖含量相当，而PEG浓度7%下的含量下降幅度较大，只有对照组的54.67%。

2.2.2 PEG胁迫对幼苗脯氨酸含量的影响

（1）脯氨酸标准曲线

图3 脯氨酸标准曲线

（2）样品中脯氨酸含量的变化

图4 丛生芽脯氨酸含量变化趋势

由以上图表可得，在苗期筛选的过程中，随着PEG浓度的增大，脯氨酸含量随之升高，在PEG浓度5%时达到最大值约55ug/g，在7%脯氨酸含量有所下降，但仍比对照组高。以对照组脯氨酸含量以指数100.00计，（PEG）1%浓度下的含量指数是其1.2737倍，（PEG）3%浓度下的含量为1.3012倍，而（PEG）5%浓度下的含量则达到1.9760倍，而（PEG）7%浓度下的含量只有对照组的1.4326倍。

2.2.3 PEG胁迫对于幼苗MDA含量的影响

（1）样品中MDA含量的变化

由上图可得，在苗期筛选过程中，随着PEG浓度的增加，丙二醛含量曲折变化，先下降后上升，但各组值均低于对照组。以对照组脯氨酸含量以指数100.00计，（PEG）1%浓度下的含量指数是其52.23%，（PEG）3%浓度下的含量则低至其42.94%，而（PEG）5%浓度下的含量为其60.5%，而（PEG）7%浓度下的含量为对照组的77.96%。

3 讨论

从本实验结果看出，桑树组织培养过程添加PEG模拟水分胁迫，桂优62桑丛生芽能抵抗的最大浓度为7%。随着PEG浓度增加，丛生芽的可溶性糖含量增加；随着PEG浓度的增大，脯氨酸含量随之升高，这与其它方法鉴定抗水分胁迫的研究结果一致，但丙二醛含量呈现先下降后上升的曲线变化，并且添加PEG以后，丙二醛含量不同程度下降。相关研究显示，细胞膜过氧化物丙二醛含量的高低与细胞膜的伤害程度一定程度上呈正相关关系，这说明丛生芽受到PEG胁迫后，细胞膜并没有受到伤害，推测可能这些浓度的PEG胁迫还不足以引起细胞膜的伤害。从本次实验结果来看，利用桑树组织培养能初步分析鉴定桑树受水分胁迫的部分生化指标，脯氨酸对水分胁迫最敏感，可溶性糖次之。

[1]王军，马双马，高玉军，等.浅谈桑树在林业可持续发展中的优势[J]，中国农学通报，2004，20（5）：72－73.

[2]秦俭，何宁佳，黄先智，等.桑树生态产业与蚕丝业的发展[J]，蚕业科学，2010，36（6）：984－989.

[3]孙宪芝，郑成淑，王秀峰.木本植物抗旱机理研究进展[J].西北植物学报，2007，27（3）：629－634.

[4]郑光华，徐本美，顾增辉.PEG引发种子效果[J].植物学报，1985，27（3）：329－333.

[5]Hohl M，Schopfer P.Water relations of growing maize coleptile：Comparison between mannitol and polyethylene glycol6000as external osmotica for a djusting turgor pressure[J].Plant Physiol，1991，95（3）：716－722.

[6]Jackson W T.Use of carbowaxes（polyethylene glycol）as osmotic agents[J].Plant Physiol，1962，37（4）：513－519.

[7]王茜龄，余茂德，徐立，等.桑子叶与胚轴不同区段离体再生植株的研究[J].蚕业科学，2005，31（3）：334－337.

[8]王学奎.植物生理生化实验原理和技术（第二版）[M].北京：高等教育出版社，2006：5.

[9]王三根.植物生理生化[M].北京：中国农业出版社，2008.

附图1 丛生芽筛选情况