EPO对Aβ1－42所致AD样大鼠空间记忆的影响及作用机制

尚俊杰，李宜培，王 黎，△

(1.郑州大学基础医学院，郑州450052;2.河南职工医学院，郑州451191)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年人常见的中枢神经退行性疾病，随着我国老龄化社会的到来［1］，此病得到越来越多的重视。其主要临床表现为认知障碍与记忆力减退，病理改变主要为细胞外的老年斑沉积、细胞内神经原纤维缠结以及胆碱能神经元数目减少等。关于AD的发病机制目前仍不清楚，但大多数学者认为神经细胞外Aβ沉积是引起AD的重要机制之一，因此在实验中常采用在动物海马或脑室注射Aβ的方法复制病理模型。促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是哺乳动物调节红细胞生成的主要调控因子，近年来，发现其除了造血功能作用外，还有其他许多重要作用，尤其是在神经保护方面的作用近年来得到越来越多的证实，但关于其对阿尔茨海默病的保护机制方面的研究还鲜见报道。本研究通过海马部位注射Aβ的方法建立动物模型，探讨EPO对AD样大鼠学习记忆能力的影响及其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 动物与分组:健康成年雄性Wistar大鼠48只，体质量270～320克，清洁级，批号 XCXK (豫)2010－0002，河南省实验动物中心提供。将其按随机数字表法分为4组:生理盐水组、AD模型组、EPO治疗组及脑复康对照组。每组各12只。

1.2 主要仪器与设备 Morris水迷宫测试系统(中国医学科学院);脑立体定位仪(淮北正华生物仪器厂);分光光度计(北京普析通用仪器有限公司);电泳仪及图像采集分析系统(Bio－Rad公司);高速冷冻离心机(eppendorf公司);Aβ1－42(Sigma公司); rHu－EPO(上海凯茂生物医药有限公司);脑复康注射液(山东威高药业有限公司);兔抗synapsin1多克隆抗体(Santa Cruz公司);兔抗β－actin多克隆抗体(Santa Cruz公司);动物组织总蛋白抽提试剂(Pierce公司);ECL化学发光试剂盒(Pierce公司);辣根过氧化物酶标记的二抗(Santa Cruz公司);显影定影试剂盒(武汉博士德公司)。

2 实验方法

2.1 Aβ孵育 将1 mgAβ1－42溶于200μL PBS，稀释为5μg/μL的浓度，置于37℃恒温箱中连续孵育12 d，使蛋白充分伸展形成聚合态，然后4℃保存使用，忌反复冻融。

2.2 AD模型建立 用6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(300～360 mg/kg)，然后将其固定于脑立体定位仪上。头顶部备皮，依次用碘伏和75%乙醇消毒。晾干后以眼眶后缘连线为起点，用手术刀片沿颅骨正中线向后切开头皮约1～1.5 cm。用眼科镊分离皮下骨膜，找到前囟，参照Pellegrino和Cushman合著的《大鼠脑立体定位图谱》［2］定位。定位方法为:以前囟为原点，向后4.0mm，中线旁2.0～2.5mm，颅骨面下进针3.0～3.5 mm。用微量进样器施行注射，每只大鼠注射2μL，缓慢注射10 min，然后原位留针10 min，使溶液充分弥散后缓慢撤针，骨蜡封闭针孔，缝合消毒。生理盐水组按照AD模型组方法在海马注射生理盐水2μL。rHu-EPO治疗组及脑复康对照组则是在大鼠模型的基础上，术后分别腹腔注射EPO和脑复康，剂量为rHu-EPO 5 000ΙU/kg，隔日一次;脑复康为40 mg/kg，每日一次。

2.3 Morris水迷宫测试 术后第二周进行行为学测试。Morris水迷宫［3］由一个不锈钢圆柱形水池和一个可移动的有机玻璃站台组成，测试数据由水迷宫图像采集和分析系统采集完成。迷宫水池高60cm，直径120 cm，人为将其分为I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个象限。有机玻璃站台直径15cm，高40cm，测试水位深度以高出平台约2 cm为宜。测试时以布包裹平台，以使大鼠在找到后能顺利爬上平台。测试水温保持在(28±2)℃，平台居于其中一个象限的中央位置，实验在光线柔和的安静环境中进行，全部试验条件在测试过程中应始终保持不变。每天定时从第Ⅰ象限开始，按顺时针顺序依次从4个象限入水各测试一次，大鼠入水瞬间立即打开图像采集软件记录游泳轨迹和时间。当大鼠找到并且爬上平台时停止记录。大鼠寻找平台的时间为潜伏期。每次测试时间为60 s。若大鼠在60 s内找不到平台，则记录为60 s。测试连续进行5 d，以每只大鼠毎天四个象限测试的平均时间长短反映其学习记忆能力。

2.4 Western blot蛋白印迹实验 水迷宫第五天测试结束后，随机从每组取6只大鼠，麻醉后立即断头，在冰上剥离海马，称重。按照重量的9倍体积加入动物组织总蛋白提取试剂、酶蛋白抑制剂PMSF (10μmol/ml)、磷酸化酶抑制剂NaF进行充分匀浆。然后进行离心(12 000 r/min，4℃，10 min)，取上清，利用bradford法测定蛋白含量。加入5×上样缓冲液加热变性10 min上样，每孔加样5μL(约30 μg)进行SDS PAGE凝胶电泳(5%浓缩胶，12%分离胶)，电泳约2 h。然后将分离的蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上，Western封闭液37℃封闭1 h。加一抗(抗体稀释液用Western封闭液，1∶1 000)，4℃孵育18 h。PBS漂洗10 min 3次。然后加HRP标记二抗(稀释液用TBS，1∶4 000)，室温孵育过夜。ECL发光液显色，X光胶片显影。Western blot蛋白印迹图像分析使用QuantityOne1.D分析软件(Bio-Rad ChemiDoxXRS凝胶成像系统)。

3 统计学处理

由于数据为非正态资料，故用多个独立样本的非参数检验(Kruskal-Wallis检验)，采用SPSS 11.0软件进行统计学处理。进一步两两比较采用排秩后单因素方差分析，以(P≤0.05)有统计学意义。

4 结果

4.1 AD大鼠Morris水迷宫空间记忆能力测试从表l可见各组大鼠随着学习次数的增加，寻找平台潜伏期均有所减少。在第2、3、4、5天的成绩中，AD模型组潜伏期时间与生理盐水组、rHu-EPO治疗组及脑复康对照组相比均明显延长，差异均有统计学意义(P＜0.05)。rHu-EPO治疗组与脑复康对照组相比差异无统计学意义。第5天与第l天相比，各组大鼠的潜伏期时间都明显缩短，但AD模型组的潜伏期时间从第2天开始不再发生明显变化，而生理盐水组、rHu-EPO治疗组及脑复康对照组均逐步下降。由于大鼠第l天迷宫测试对环境生疏，为减少由此造成的误差，故选用相对稳定的第2天成绩做对照。从表l可见，第5天与第2天的潜伏期时间相比较，AD模型组无明显差异，而生理盐水组、rHu-EPO治疗组及脑复康对照组第5天的潜伏期时间较第2天明显缩短，差异均有统计学意义(P＜0.05)。如图1上方显示第5天各组大鼠寻找平台的轨迹图，与AD模型组相比，生理盐水组、rHu-EPO治疗组及脑复康对照组寻找路线均明显缩短。

图1 与组内第2天与第5天相比P＜0.05

表1 各组大鼠Morris水迷宫测试结果(±s，t/s，n=12)

表1 各组大鼠Morris水迷宫测试结果(±s，t/s，n=12)

注:与生理盐水组比较，1)P＜0.05;与模型组比较，2)P＜0.05。

组别 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 χ2 P值生理盐水组 21.49±7.37 20.36±8.04 7.24±5.44 11.38±9.357.80±2.72 22.49 0.005模型组 21.46±5.38 30.19±18.14 12.44±8.431) 14.56±17.361) 16.68±17.271) 7.28 0.063 rHu-EPO组 16.94±6.33 16.93±5.89 5.42±2.512) 6.68±4.362) 5.65±8.222) 14.77 0.002脑复康组 16.83±13.40 16.33±11.50 5.02±4.002) 6.30±3.272) 5.26±3.032) 20.49 0.000 χ2 4.69 6.33 7.90 10.44 13.33 P值0.196 0.096 0.048 0.015 0.004

图3 各组大鼠海马神经元中synapsinl蛋白表达Western blot检测结果rHu-EPO治疗组、脑复康对照组、生理盐水组三者之间比较，P＞0.05;rHu-EPO治疗组及脑复康对照组与AD模型组比较，P＜0.05 3A:Western blot条带;3B:Synapsin1蛋白表达的柱状图

4.2 Western blot检测synapsinl蛋白的表达变化如图3所示:各组海马组织中均可见synapml蛋白表达。与生理盐水组相比，AD模型组表达略减少，但差异无统计学意义;与AD模型组相比，rHu-EPO治疗组及脑复康对照组synapsinl蛋白表达明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。

5 讨论

本实验采用国内外常用的AD模型制作方法［4-5］，即利用脑立体定位仪向海马部位注射凝聚态Aβ1－42，在术后第八天做Morris水迷宫试验。结果显示:与生理盐水组相比，AD模型组潜伏期明显延长，说明AD模型组的学习记忆能力受损。生理盐水组大鼠通过连续5 d的学习，使找到平台的潜伏期持续缩短，表明具有策略性、定位准确，轨迹图由环绕型变为直线型。AD模型组第5天的潜伏期与第2天相比没有差异，轨迹图显示在第5天搜索平台路线还是环绕型，缺乏策略性、定位不准确，说明其学习记忆能力下降。

关于rHu-EPO神经保护作用的研究国内外已经有一定的报道［6－13］，但其在实验动物中的神经保护机制还不明确。本实验发现rHu-EPO治疗组及脑复康对照组与AD模型组相比潜伏期时间显著缩短，搜索策略性强，定位明确，说明rHu-EPO可以改善由Aβ1－42所致AD大鼠的空间记忆能力的损害，推测rHu-EPO具有一定的提高学习记忆能力的作用。synapsinl是一种神经元特异的磷蛋白，分为synapsinla和synapsinlb两种亚型。synapsinl蛋白表达不仅在海马结构的形成及功能可塑性起到一定作用［14］，而且在突触发生、突触囊泡运输及神经递质释放过程中也起到重要的调节作用。研究证实AD患者新皮层和海马神经元轴突及树突萎缩，突触减少是患者出现痴呆的主要原因。本实验研究发现:与生理盐水组相比，AD模型组海马组织中synapsinl蛋白表达降低，是由于Aβ1－42对神经元的毒性作用，间接抑制了synapsin1蛋白表达。rHu-EPO治疗组与AD模型组相比synapsin1蛋白表达显著增加，说明rHu-EPO具有拮抗Aβ1－42对神经元毒性作用，增加synapsinl蛋白表达，引起递质释放增加，提高突触传递能力，这可能是rHu-EPO改善AD大鼠学习记忆能力的另一个机制;另外rHu-EPO治疗组与生理盐水组相比，rHu-EPO治疗组synapsinl蛋白表达增加，提示rHu-EPO对正常大鼠也有促进synapsinl蛋白表达的作用。rHu-EPO可以改善大鼠由Aβ1－42引起的学习记忆障碍，提高学习记忆能力，这与增加synapsinl蛋白表达促进突触发生有关，其深层机制仍有待进一步探索。

［1］ 程 琦，程晓娟，姜国鑫.我国阿尔茨海默病流行病学研究［J］.内科理论与实践，2007，2(02):70－74.

［2］ Pellegrino LJ，Cushman AJ，Pellegrino AS.A stereotaxic atlas of the rat brain［J］.1967.

［3］ 陈罗西，郭玲玲，李 亮.Morris圆形水迷宫的应用及其相关检测指标分析［J］.辽宁中医药大学学报，2008，10(08):55－57.

［4］ Frautschy SA，Yang F，Calderon L，et al.Rodent models of Alzheimer＇s disease:rat A beta infusion approaches to amyloiddeposits［J］.Neurobiol Aging，1996，17(2):311－321.

［5］ Dodart JC，May P.Overview on rodentmodels of Alzheimer＇s disease［J］.Curr Protoc Neurosci，2005，Chapter 9:Unit9.22.

［6］ 曾 志，周卓妍，宋燕燕，等.促红细胞生成素对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经保护作用的研究［J］.2011，76(2):155－159.

［7］ 陈 涛，章军建，余 芬，等.促红细胞生成素对慢性脑缺血大鼠空间学习记忆能力的影响［J］.武汉大学学报(医学版)，2006，49(02):225－228+279.

［8］ 陈 达，王斯闻，朱 杰，等.促红细胞生成素对脑出血神经生长因子表达的影响［J］.中国医学工程，2010，9(04):41－42.

［9］ Morishita E，Masuda S，Nagao M，etal.Erythropoietin receptor is expressed in rat hippocampal and cerebral corticalneurons，and erythropoietin prevents in vitro glutamate－induced neuronal death［J］.Neuroscience，1997，76(1):105－116.

［10］ Sinor AD，Greenberg DA.Erythropoietin protects cultured cortical neurons，but not astroglia，fromhypoxia and AMPA toxicity［J］.Neurosci Lett，2000，290(3):213－215.

［11］ Siren AL，Fratelli M，Brines M，et al.Erythropoietin prevents neuronal apoptosis after cerebral ischemia and metabolic stress［J］.Proc Natl Acad Sci U SA，2001，98(7):4 044－4 049.

［12］ Digicaylioglu M，Lipton SA.Erythropoietin－mediated neuroprotection involves cross－talk between Jak2 andNF－kappaB signalling cascades［J］.Nature，2001，412(6 847):641－647.

［13］ Villa P，Bigini P，Mennini T，et al.Erythropoietin selectively attenuates cytokine production and inflammation incerebral ischemia by targeting neuronal apoptosis［J］.Exp Med，2003，198 (6):971－975.

［14］ Holgado A，Ferreira A.Synapse formation proceeds independently of dendritic elongation in culturedhippocampal neurons［J］.Neurobiol，2000，43(2):121－131.