IT－ISJ标记及其在大麦遗传多样性研究中的应用

余春磊刘家娴，2齐国昌罗小娇刘新春冯宗云*

(1.四川农业大学农学院植物遗传育种学系大麦研究中心，四川温江611130; 2.四川甘孜藏族自治州农业科学研究所，四川康定626000)

IT－ISJ标记及其在大麦遗传多样性研究中的应用

余春磊1刘家娴1，2齐国昌1罗小娇1刘新春1冯宗云1*

(1.四川农业大学农学院植物遗传育种学系大麦研究中心，四川温江611130; 2.四川甘孜藏族自治州农业科学研究所，四川康定626000)

本研究首次利用一种新的分子标记IT－ISJ(Intron－targeted intron－exon splice junction，内含子－外显子拼接位点)对34份来自中国青藏高原、欧洲和北美的栽培青稞品种(系)进行了多态性分析。结果表明:20对引物组合共扩增出87条条带，平均每对引物组合4.35条条带。其中81条具有多态性，多态性条带为93.10%。共扩增出134个等位变异，变幅为2～11个，平均每个引物对检测到6.7个。34份材料间的遗传相似系数(GS)变幅在0.437～0.931之间，平均为0.743±0.094。材料间平均遗传距离较低，仅为0.257，遗传多样性在0.2509～0.8460之间，平均为0.59。本结果表明IT－ISJ标记能有效用于大麦遗传多样性分析、品种鉴定，遗传图谱构建及分子标记辅助选择育种中。因此，大麦育种者在杂交育种中应广泛发现和挖掘优异青稞资源，扩大青稞种质的遗传基础，提高青稞育种效率。

大麦;青稞;IT－ISJ;遗传多样性

大麦(Hordeumvulgare L.)是世界上最古老的栽培作物之一，具有早熟、抗逆性强、适应性广等特性，主要用作牲畜饲料、啤酒工业原料，还具有酿造、美容、食用、保健等多种用途，已受到大麦育种者及食品加工企业的高度关注。多种分子标记的开发，有利于大麦高密度分子遗传图谱的构建、基因定位、QTL作图、遗传多样性评价、标记辅助选择育种及品种鉴定等研究。在大麦上，应用较多的分子标记包括RAPD、RFLP、SSR、AFLP等，SRAP应用较少［1，9］。但这些分子标记各有其优缺点。寻找设计引物简单，操作简便，稳定性高的新标记是大麦育种及分子生物学者努力追求的目标。

IT－ISJ(Intron－targeted intron－exon splice junction，内含子－外显子拼接位点)标记是郑靓等(2008)［2］根据植物基因内含子剪接位点保守序列参照Weining and Langridge(1991)［8］的方法设计合成的。具体为前引物的核心部分为5’端剪接位点保守序列CAGGTAACT，并在其5’端和3’端分别加上限制性内切酶SPhl的识别序列GCATGC和3个选择性碱基。后引物的核心部分为3’端剪接位点保守序列ACCTGCA，并在其5’端和3’端分别加上限制性内切酶EcoRI的识别序列GAATTC和任意3个选择碱基。此标记已在棉花［2］、花生［3］、苹果［4］中应用于品种鉴定、构建遗传图谱、遗传多样性分析，具有多态性高、稳定性好、成本低等优点。但该标记应用于大麦上尚未见报道。

本研究以栽培青稞品种(系)为材料，采用IT－ISJ标记技术分析了该标记在大麦中应用的可行性，并评价了这些材料间的遗传关系，可为大麦育种、品种鉴定、新品种保护与利用提供依据。

1材料与方法

1.1实验材料

供试材料共34份，包括西藏材料9份(XZ1－XZ9)、甘肃材料5份(GS1－GS5)、四川材料5份(SC1－SC5)及9份青海材料(QH1－QH9)和6份国外材料(AB1－AB6)。其名称及来源见表1。这些材料现保存于四川农业大学大麦研究中心。

1.2方法

1.2.1 gDNA的提取。gDNA提取采用CTAB法［6］。每份材料取新鲜健康的幼叶约300 mg，置于液氮中迅速研磨至粉末，随后将粉末转移到2 ml离心管中，加入800μL65℃预热的2× CTAB提取液［0.2 mmol/L Tris－HCL(PH约8.0)，0.02 mmol/L EDTA，55 mmol/L CTAB，2%β－巯基乙醇)］于65℃水浴至少50 min，期间轻轻颠倒混匀几次，取出离心管冷却至室温，然后加入800μL氯仿:异戊醇(24:1)轻摇10 min后静置30 min，11 000 r/min离心15 min，取上清液加入等体积的异丙醇沉淀DNA，用70%乙醇冲洗2次，90%乙醇再冲洗1次，干燥后加入50μl灭菌的ddH2O，用紫外分光光度计检测其浓度与质量。将DNA稀释至20 ng/μL于－20℃保存备用。

1.2.2 IT－ISJ反应体系。PCR引物(表2)采用郑靓等［2］已发表的引物，由上海英捷贸易有限公司合成。引物组合以正反向引物名称的最后两个字母组合表示。PCR扩增通过正交试验设计选出最佳体系，总体积20μL，包括20 ng/μL模板DNA 2μL，1.5 mmol/L的MgCl2，0.2 mmol/L的dNTPs，0.5μmol/L引物，1U Taq聚合酶，2μL 10×PCR buffer。在PTC－200扩增仪上完成。反应程序为:94℃预变性5 min，94℃变性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸lmin，40个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。

表1 供试栽培青稞品种(系)名称、编号及来源

表2 IT－ISJ引物名称及核苷酸序列

1.2.3扩增产物的检测。扩增产物加3×Loading-Buffer 10μL，95℃变性5 min后，用预热30 min的8%变性聚丙烯酰胺凝胶恒功率75 w电泳，至指示剂离胶板底部三分之一处(约45 min)，取下胶板。采用银染法检测［5］。用数码相机拍照，统计带型。

1.2.4数据的处理。对IT－ISJ扩增产物的电泳结果采用0、1、－9统计建立数据库，在相同迁移位置有带记为1，无带记为0，模糊不清或其他原因记为－9。遗传多样性指数(H)按H=1－∑Pi2(Nei等，1979)［7］计算，其中Pi为某座位第i个等位变异的频率。利用NTSYS－pc统计分析软件计算遗传相似系数(GS)。计算公式为:GS= 2Nij/(Ni+Nj)，其中Nij为材料i和j共有的扩增片段数，Ni为材料i中出现的扩增片段数，Nj为材料j中出现的扩增片段数。

2结果与分析

2.1引物组合筛选

用10个正向引物和12个反向引物组成的120对引物组合，对选取的两个品种(北青2号、北青3号)进行多态性筛选，其中74对引物能扩增出条带，占引物组合总数的61.67%。有55对引物组合能扩增出多态性，多态性比例占45.83%。并用相同引物对和模板进行多次扩增和电泳，其带型没有变化，表明IT－ISJ标记在大麦上具有较好的重现性。从这55对引物中选取扩增性较好、重复性较高的20对引物对所有材料进行多态性分析，统计在100～2 000 bp之间能够清晰可辨的电泳条带。其中，引物组合IT－ISJ02F47R可区分11个品种，而引物组合IT－ISJ08F52R、ITISJ08F54R、IT－ISJ08F55R和IT－ISJ11F54R各自能区分10个品种。特别是可用5个引物组合(IT－ISJ02F08R、IT－ISJ02F42R、IT－ISJ08F52R、IT－ISJ08F54R、IT－ISJ08F55R)就能将本试验中的34份材料区分开，占引物组合总数的25.00%。

2.2多态性分析

图1为引物组合IT－ISJ05F18R扩增产物部分电泳图。发现不同的引物对扩增的条带数、扩增带型都不同(表3)。从表3看出，在总样本中，20对引物组合共产生清晰可辨的条带数为1～8条，大部分在4条以上，总计87条，平均每个引物对4.35条，其中81条具有多态性，平均多态性条带为4.05条，多态性条带为93.10%。在这20对引物中，3个引物对IT－ISJ02F18R、ITISJ11F46R、IT－ISJ05F18R的多态性条带比率分别为50.00%、60.00%、71.42%，其余17对引物的多态性条带比率为100%。这表明IT－ISJ标记适合于对大麦进行DNA多态性分析。

图1 引物组合IT－ISJ05F18R扩增产物部分电泳图(M:DL2000;1:喜马拉雅2号;2:喜马拉雅4号; 3:喜马拉雅5号;4:喜马拉雅6号;5:喜马拉雅10号; 6:喜马拉雅16号;7:喜马拉雅17号;8:喜马拉雅19号;9:喜马拉雅22号;10:甘青4号;11:甘青5号; 12:9619;13:9640;14:9718;15:白六棱)

2.3等位变异与遗传相似性

从表3可知，20对引物共扩增出134个等位变异(带型)，变幅在2～11个，平均每个引物对检测到6.70个。34份材料间的遗传相似系数(GS)变幅在0.437～0.931之间，平均为0.743± 0.094。其中，l来自墨西哥的CI－424(AB4)和北青3号系选的SC5间相似系数最小(0.436)，而北青1号(QH2)和北青2号(QH3)间相似系数最大，达0.931。供试材料中，相似系数＜0.75的材料组合有238个，占组合总数的42.42%，相似系数＞0.75的材料组合有323个，占所有供试组合的57.58%。材料间平均遗传距离较低，仅为0.257，遗传多样性在0.2509～0.8460之间，平均为0.59。这表明供试材料间的遗传差异较小。

表3 IT－ISJ引物组合的多态性与等位变异

3讨论与小结

IT－ISJ(intron targe red intron－exon splice junction，内含子－外显子拼接位点)DNA分子标记技术是近年来由郑靓等(2008)［2］开发出的，具有多态性高、稳定性好、引物设计简便、操作简单、成本低等优点，已在陆地棉［2］、花生［3］、苹果［4］上有报道。但该标记应用于大麦上还未见报道。在本研究中，我们首次用IT－ISJ的10个正向引物和12个反向引物组成120对引物，对选取的2个青稞品种(北青2号、北青3号)进行了引物对的筛选。筛选出多态性较高、带型丰富、条带清晰的引物组合55个，占引物组合总数的45.83%，远高于纪君超等(2010)［4］在加工苹果品种中报道的结果。从55对引物组合中选取20对引物组合对34份青稞品种(系)进行了多态性分析，共扩增出87条带，其中多态性带81条，平均每对引物组合扩增出4.05条带，多态性百分率为93.10%。而多态性高达100%的引物组合数达17个，占85.00%，明显高于郑靓等(2008)［2］在陆地棉、于树涛等(2009)［3］在花生上及纪君超等(2010)［4］在苹果中所得结果。在这20对引物中，3个引物对IT－ISJ02F18R、IT－ISJ11F46R、ITISJ05F18R的多态性条带比率分别为50.00%、60%、71.42%。从图1和表3看出，不同的引物对扩增的条带数、扩增带型都不同。引物组合IT－ISJ02F47R可区分11个品种，而引物组合ITISJ08F52R、IT－ISJ08F54R、IT－ISJ08F55R和IT－ISJ11F54R各自能区分10个品种。特别是仅用5个引物组合(IT－ISJ02F08R、IT－ISJ02F42R、IT－ISJ08F52R、IT－ISJ08F54R、IT－ISJ08F55R)就能将本试验中的34份材料区分开，占引物组合总数的25.00%。上述结果表明，采用IT－ISJ引物组合对青稞品种(系)能扩增得到条带清晰、稳定性较好、多态性较高的条带、且操作简单、成本较低，这表明IT－ISJ标记应用在大麦上是可行的，将在大麦遗传多样性分析、品种鉴定，遗传图谱构建及分子标记辅助选择育种中得到广泛的应用。

34份材料间的遗传相似系数(GS)变幅在0.437～0.931之间，平均为0.743±0.094。供试材料中，相似系数＜0.75的材料组合有238个，占组合总数的42.42%，相似系数＞0.75的材料组合有323个，占所有供试组合的57.58%。材料间平均遗传距离仅为0.257，平均遗传多样性为0.59。这表明供试材料间的遗传差异较小，遗传基础较窄，遗传关系较近。因此，大麦育种者在杂交育种中应广泛发现和挖掘优异青稞资源，扩大青稞种质的遗传基础，提高青稞育种效率。

［1］杨平，刘仙俊，刘新春，等.利用SRAP标记研究四川高原青稞育成品种的遗传多样性［J］.遗传，2008，30(1):115－122

［2］郑靓，张正圣，陈利，等.IT－ISJ标记及其在陆地棉遗传图谱构建中的应用［J］.中国农业科学，2008，41(8):2241－2248

［3］于树涛，王传堂，王秀贞，等.IT－ISJ标记在花生上的应用研究［J］.花生学报2009，38(3):10－14

［4］纪君超，王传堂，张玉刚，等.应用IT－ISJ标记分析加工苹果品种的遗传关系［J］.青岛农业大学学报，2010，27(3):200－204

［5］Bassam BJ，Caetano－Anolles G，Gresshoffet P.Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels.Analytical Biochemistry，1991，196(1):80－83

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［7］NeiM，LiW H.Mathematicalmodel for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases［J］. Proc Natl Acad Sci USA，1979，76:5269－5273

［8］Weining S，Langridge P.Identification and mapping of polymorphisms in cereals based on the polymerase chain reaction，Theoretical and Applied Genetics，1991，82: 209－216

［9］Yang Ping，Xianjun Liu，Xinchun Liu，et al.Diversity analysis of the developed qingke(hulless barley)cultivars representing different growing regions of the Qinghai－Tibet Plateau in China using sequence－related amplified polymorphism(SRAP)markers.African Journal of Biotechnology.2010，9(50):8530－8538

IT－ISJM arkers and Its Application to the Genetic Diversity in Barley

YU Chun－Lei1，LIU Jia－Xian1，2，QIGuo－Chang1，LUO Xiao－Jiao1，LIU Xin－Chun1，FENG Zong－Yun1
(1．Barley Research Centre，Department of Plant Genetics and Breeding，College of Agronomy，Chengdu Campus，Sichuan Agricultural University，Wenjiang 611130，China;2．Ganzi Institute of Agricultural Sciences，Cangding 626000，China)

IT－ISJ(Intron－targeted intron－exon splice junction)，a new molecularmarker，themolecular polymorphism of 34 cultivated hulless barley cultivars(lines)from the Qinghai－Tibet Plateau of China，the Europe and the North America，which was reported firstly in this study．The result showed that，20 primer combinations produced a total of87 clear bandswith an average of4．35 bands per primer pair，and which 81bands(93．10%)were polymorphic．134 alleles，ranged from 2 to 11，were amplified with an average of 6．7 alleles per primer pair．Genetic similarities ranged from 0．437 to 0．931，with an average of 0．743．The average genetic distance(0．257)was lower among accessions and average genetic diversity(0．59)，so the result indicated that the genetic basis is narrower among accessions．Based on the results，IT－ISJmarker could be effectively used in researching genetic diversities，cultivar identifications，construction of geneticmap and molecularmarker－assisted selection breeding．Therefore，it is very essential that the excellent hulless barley genetic resources should be extensively discovered and excavated to widen the genetic basis of hulless barley genetic resources and increase the efficiency in hulless barley breeding．

Barley;Hulless Barley;IT－ISJMarker;Genetic Diversity

2012－11－11

现代农业产业技术体系建设基金(CARS－05)、四川省教育厅重点项目、四川农业大学科技成果转化专项基金。

同等贡献作者简介:余春磊(1989－)，男，在读硕士生，主要从事大麦育种与分子生物学研究。

刘家娴(1983－)，女，农业推广硕士，助理农艺师，主要从事青稞栽培与育种研究工作。

*通讯作者:冯宗云(1963－)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事大麦遗传育种及分子生物学研究。