微生物固定法降解含聚废水的最佳条件＊

刘江红，潘 洋，徐瑞丹

（1.东北石油大学化学化工学院，黑龙江大庆 163318； 2.厦门大学生命科学学院，福建厦门 361005）

随着采油技术不断发展，先后经历了1次、2次和3次采油.特别是3次采油，其本质就是为了改善驱油效果，向水中添加化学试剂，主要是聚合物、表面活性剂和碱.随着采油用聚丙烯酰胺（HPAM）驱油的大量应用，使采油污水的成分更加复杂，采油污水中的聚丙烯酰胺对环境的污染日趋严重且难以处理［1］.因此含聚废水处理成为一个急需解决的问题.

生物法处理含聚废水是目前环保、有发展前景的方法，但目前生物法仍停留在利用游离态微生物降解含聚废水阶段，游离态微生物易流失，利用率低，且难以回收利用.本实验采用微生物固定化方法处理含聚废水，微生物固定化的优点在于利用物理或化学方法将游离的微生物定位在限定的空间区域，使其保持活性并可反复使用，在适宜的条件下还可以增殖.微生物固定化后，对有毒有害物质的抵抗能力及对有机物的降解能力都有明显的提高［2］，同时固定化微生物技术能够克服菌体易流失等缺点［3］.目前微生物固定化已经在工业、医学、化学分析、能源开发等［4－5］领域得到广泛的应用.固定化技术中的包埋法操作简单，对微生物活性影响小，制作的固定化微生物小球的强度高［6］.固定剂聚乙烯醇（PVA）加热后易溶于水，将微生物包埋固定在凝胶中.但PVA凝胶颗粒具有非常强的附聚倾向，使颗粒间黏结不易分开，颗粒的机械强度、沉降性、通透性也有待于提高.Rao等［7］用海藻酸钠固定化乳酸杆菌用来生产纯L（＋）乳酸以评价小球的稳定性.海藻酸钠无毒不易被降解，但海藻酸钠法包埋形成的凝胶小球抗冲击负荷能力差［8］.

因此，本实验采用微生物固定化技术中的包埋法处理含聚废水，选用海藻酸钠与聚乙烯醇结合的新型包埋剂组合，希望增强固定化小球的机械强度、沉降性、通透性和抗冲击负荷能力，以增强对含聚废水中HPAM的降解能力，同时对海藻酸钠－聚乙烯醇固定法的制备条件进行研究，寻找降解含聚废水的最佳固定化制备条件.

1 实验材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 主要设备

722型分光光度计，上海光谱仪器有限公司；高速离心机，长沙英泰仪器有限公司；电子天平，岛津国际贸易有限公司；高压灭菌锅，上海申安医疗器械厂；pH计，上海虹益仪器仪表有限公司；恒温振荡培养箱，上海森信实验仪器有限公司；冰箱，泰州乐金电子冷机有限公司；电炉，天津市泰斯特仪器有限公司；接种环；接种针；酒精灯；胶头滴管；棉塞；玻璃仪器等.

1.1.2 菌株来源

实验室保藏菌株，筛选自大庆采油厂含聚废水，命名为R4－1，R4－2，R4－3，R4－5，H4－3.实验室初步鉴定R4－1为芽孢乳杆菌属，R4－2为微球菌属，R4－3为芽孢杆菌属，R4－5为芽孢八叠球菌属，H4－3为芽孢杆菌属.

1.1.3 培养基

1）保藏培养基和富集培养基：牛肉膏蛋白胨培养基.2）活化培养基（用于降解聚丙烯酰胺菌株活化）：聚丙烯酰胺0.5g，尿素9g，蛋白胨6g，KH2PO40.5g，NaCl 0.5g，MgSO40.5g，蒸馏水1 000mL.3）基础培养基：聚丙烯酰胺0.5g，蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，加蒸馏水到1 000 mL调至pH＝7.0.主要用于利用混合菌降解聚丙烯酰胺.（淀粉－碘化镉法测得大庆采油厂的含聚废水中聚丙烯酰胺的质量浓度为500.24mg·L－1）.

1.1.4 试 剂

三水合硫酸铝，天津市塘沽鹏达化工厂；冰醋酸，天津市博迪化工有限公司；七水合硫酸亚铁，天津市博迪化工有限公司；碘化镉，北京恒业中远化工有限公司；海藻酸钠，天津市凯通化学试剂有限公司；氟化氢铵，聚乙烯醇（PVA），天津市四通化工厂；无水氯化钙，天津市天达净化材料精细化工厂；SiO2，上海化学试剂总厂；CaCO3，天津市大茂化学试剂厂；硼酸，天津市博迪化工有限公司；活性碳，天津市塘沽天达净化材料精细化工厂，以上试剂均为分析纯；可溶性淀粉，生物试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司；聚丙烯酰胺，大庆采油厂.

1.2 实验方法

1.2.1湿菌体制备

聚丙烯酰胺是难降解的高分子聚合物，需要利用微生物的共代谢作用，因此选取混合菌作为实验研究对象.将5种菌混合作为固定化菌体，利用活化培养基连续活化4次，以增强菌体对HPAM的适应和降解能力.取活化后的培养液2mL加入到富集培养基中培养2～3d，让菌体大量繁殖，大量繁殖后的菌体经离心机离心，得到湿菌体.

1.2.2 微生物固定化

蒸馏水配置不同浓度配比的海藻酸钠与PVA载体溶液，用5mL注射器吸取上述载体溶液，将其滴入按一定比例配置的交联剂中，交联一定时间，将含有菌体的固定化颗粒放入基础培养基中，35℃，120r·min－1振荡培养箱中培养去降解聚丙烯酰胺.

1.2.3 降解率的测定

淀粉－碘化镉法测聚丙烯酰胺降解率，制作标准曲线.

1.2.4 固定化颗粒性能测定

1）固定化颗粒强度测试：将交联24h的固定化颗粒经蒸馏水冲洗2次后，取出30个均匀的颗粒放入35℃，120r·min－1振荡培养箱中.24h后观察颗粒破损情况.

2）固定化颗粒渗透性测试：将颗粒没入墨水中，5min后取出.分别在颗粒距中心0，1／2，1／4处切片观察浸湿程度.每组数据为8颗颗粒测试平均值.

2 结果与讨论

2.1 标准曲线绘制

以聚丙烯酰胺质量分数为横坐标，OD420值为纵坐标绘制的吸光度与聚丙烯酰胺质量分数标准曲线，曲线的线性回归方程为y＝0.038 5 x＋0.002 7，R2＝0.999 6.

2.2 海藻酸钠－聚乙烯醇（PVA）固定化降解含聚废水最佳条件研究

本实验采用海藻酸钠与PVA相结合作为固定化的包埋剂，对5种菌的混合菌进行固定化实验.

2.2.1 海藻酸钠质量分数对成球性的影响

分别配置质量分数为1%，2%，3%，4%，5%的海藻酸钠溶液，将其滴入3%氯化钙溶液中，成球难易程度如表1所示.由表1可以看出，海藻酸钠质量分数一般在2%～4%时小球制作成型容易、速度快，凝胶的封闭性好.

表1 海藻酸钠质量分数对固定化成球性的影响Tab.1 Effect of mass fraction of Sodium Alginate on ballability of immobilization

2.2.2 海藻酸钠－PVA不同质量分数配比对固定化颗粒的影响

考虑到固定化颗粒制作难易程度，将海藻酸钠－PVA混合液质量分数定位在8%，将海藻酸钠与PVA按不同质量分数配比混合，滴入3%氯化钙与3%的硼酸中，交联24h.不同质量分数配比海藻酸钠－PVA对成球性的影响如表2所示，不同质量分数配比海藻酸钠－PVA固定化颗粒性能测定如表3所示.由表2与表3得知，由3%的海藻酸钠和5%的PVA与4%的海藻酸钠和4%的PVA制得的固定化颗粒形状规则，成球速度快，且制备简单.但3%的海藻酸钠和5%的PVA固定化颗粒渗透性相对于4%的海藻酸钠和4%的PVA固定化颗粒渗透性较差，且易破损.因此，决定选取4%的海藻酸钠与4%的PVA作为微生物固定化的包埋剂.

表2 不同质量分数配比海藻酸钠－PVA对成球性的影响Tab.2 Effect of different mass fraction of Sodium Alginate－PVA on ballability

表3 不同质量分数配比海藻酸钠－PVA固定化颗粒性能测定Tab.3 Inspect of function on different mass fraction of Sodium Alginate－PVA immobilization kernel

2.2.3 海藻酸钠－PVA固定化制备条件研究

湿菌体与包埋剂的体积比对微生物固定化降解聚丙烯酰胺有一定的影响，海藻酸钠需要在氯化钙中固化，而PVA需要在硼酸中固化.因此，选定湿菌体与包埋剂体积比、CaCl2溶液质量分数、硼酸溶液质量分数、CaCl2与硼酸分步交联时间作为正交试验的4个影响因素，每个因素选3个水平，考察固定化颗粒对HPAM降解率的影响，如表4所示.选用正交表L9（34）进行4因素3水平的正交实验，以确定制备的含有活菌体的固定化颗粒降解聚丙烯酰胺的最佳条件.正交实验数据及其极差分析结果如表5所示.

由表4和表5可知，在上述4种影响因素中，固定化制备条件对聚丙烯酰胺的降解率影响因素大小为：湿菌体与包埋剂体积比＞硼酸质量分数＞氯化钙质量分数＞交联时间.湿菌体与海藻酸钠体积比对降解率的影响远大于其他3个条件.最佳的固定化颗粒制备条件为A1B2C2D1，即当氯化钙质量分数为2%和硼酸质量分数为3%，分阶段交联，在氯化钙中交联4h后转入硼酸中交联20h，湿菌体与包埋剂体积比为1∶1.湿菌体与包埋剂体积比对聚丙烯酰胺降解率的影响十分显著.

方差分析结果如表6所示，湿菌体与包埋剂体积比对聚丙烯酰胺降解率影响十分显著，交联时间对降解率影响很小.

表4 正交实验因素水平Tab.4 Levels and factors of orthogonal experiment

表5 L9（34）正交实验结果Tab.5 L9（34）orthogonal results

表6 方差分析Tab.6 Variance analysis

2.2.4 追加实验

通过以上正交实验得到最佳固定化颗粒制备条件为A1B2C2D1，而在9组实验中并不包含这一水平组合，因此按照A1B2C2D1的实验条件做追加实验.追加实验条件下固定化小球对HPAM的降解率为83.1%，高于前9次实验条件下的降解率.

3 结 论

1）利用海藻酸钠－PVA混合载体固定法时，海藻酸钠质量分数一般在2%～4%时固定化小球制作成型容易、速度快，凝胶的封闭性好.

2）海藻酸钠－PVA混合载体中在海藻酸钠的质量分数为4%，PVA的质量分数也为4%时，制得的固定化颗粒渗透性和强度好，且颗粒制备容易.

3）选定湿菌体与包埋剂体积比、硼酸质量分数、氯化钙质量分数、交联时间作为正交试验的4个影响因素，考察固定化颗粒对HPAM降解率的影响.方差分析结果表明，固定化颗粒最佳制备条件是氯化钙质量分数为2%和硼酸质量分数为3%、分阶段交联、在氯化钙中交联4h后转入硼酸中交联20h、湿菌体与包埋剂体积比为1∶1.固定化制备条件对聚丙烯酰胺降解率影响因素大小依次为：湿菌体与包埋剂体积比＞硼酸质量分数＞氯化钙质量分数＞交联时间.

4）按照最佳的固定化颗粒制备条件做追加实验，实验结果表明在此条件下混合菌固定化颗粒对HPAM降解率达到83.1%，高于前9次实验条件下的降解率.

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