感染猪放线杆菌（Ⅰ型）对猪红细胞免疫功能的影响

左之才，崔恒敏，甘 梦，彭 西，邓俊良

（1.四川农业大学动物医学院，环境公害与动物疾病四川省高校重点实验室，四川 雅安 625014；2.动物疫病与人类健康四川省高校重点实验室，四川农业大学，四川雅安625014）

红细胞不仅具有黏附、杀伤抗原的作用[1]，而且参与机体免疫，对机体免疫性疾病尤其是免疫复合物的清除发挥着重要作用[2]。1981年，Siegel等设计出检测红细胞免疫黏附受体活性的“标准的红细胞免疫黏附试验”[3]。1982年，郭峰等在Siegel标准试验的基础上，建立了红细胞C3b受体（C3bR）花环（Erythrocyte C3b receptor rosette，E-C3bRR）试验和红细胞免疫复合物（IC）花环（Ecthrocyte immune complex rosette，E-ICR）试验，分别测定红细胞C3b受体活性和红细胞膜上吸附免疫复合物的情况[4]。近年来，国外红细胞免疫研究不多[5]；而在国内，红细胞免疫功能在疾病发生、发展中的作用则受到普遍关注，动物疾病方面的研究报道则主要集中在家禽[6-11]，家畜研究较少[12-15]。本研究通过人工感染猪放线杆菌（Ⅰ型）病例模型研究细菌感染对猪红细胞免疫功能的影响，为进一步研究感染与机体天然免疫关系及感染性疾病的防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

猪APP（血清I型），由四川农业大学生物技术中心提供。经胰胨大豆琼脂培养基纯化、无菌检查及染色特性观察后，接种胰胨大豆肉汤培养基，37℃恒温培养6～8 h，用TSA琼脂平版培养计数法计算每毫升含有的菌落形成单位（cfu·mL-1），在此条件下菌液生长浊度可达108～109cfu·mL-1。攻毒前用无菌生理盐水稀释成3.5～4×107cfu·mL-1。

1.2 饲粮组成与饲养管理

试验饲粮参照NRC（1998）推荐和NY-T 65-2004猪饲养标准10～20 kg仔猪的营养需要配制。猪自由饮水，饲喂无抗生素添加剂的常规饲料，并在试验前饲养l周，使猪适应环境。

1.3 动物分组及处理

选取相同日龄、体重相近（15～20 kg）、经临床及血清学检查排除APP感染，处于健康状态的DLY（杜洛克×长白×约克夏）仔猪24头；按♂、♀，来源及体重两两配对，随机分为两组，接种无菌生理盐水（对照组，CG）和APP稀释液（试验组，TG）。采用鼻腔喷雾法，按每kg体重0.25 mL，TG仔猪一次性接种上述APP稀释液；CG采用无菌生理盐水。

1.4 样本采集与血常规指标检测

于接种后48 h每组随机选择8头仔猪，无菌采集前腔静脉血15 mL，1 mL枸橼酸纳抗凝（放于4℃冰箱保存作红细胞免疫试验），2 mL EDTA-K2抗凝（检测血常规0.5 mL），剩余血分离血清，备用（制备致敏酵母多糖等）。

1.5 血液常规检测

BC-2000血细胞自动分析仪检测白细胞总数（WBC）、淋巴细胞数（LYM）、中间细胞计数（MID）、中性粒细胞计数（GRA）、红细胞总数（RBC）、平均红细胞体积（MCV）、血红蛋白（HGB）、平均红细胞血红蛋白（MCH）、平均血红蛋白浓度（MCHC）等。

1.6 红细胞免疫功能测定

1.6.1 红细胞悬液的制备

将CG、TG红细胞（枸橼酸纳抗凝）悬液（静脉血）经生理盐水洗涤离心3次（每2000 r·min-1，3～5 min），按红细胞计数方法配成1.25×107个·mL-1使用液备用。

1.6.2 致敏酵母多糖的制备

冻干补体未致敏酵母多糖（购于上海长海医院免疫室）。用EP管取酵母多糖溶液5 mL，离心2000 r·min-1，3～5 min，弃一半上清液，加入健康猪血清2.5 mL混匀，37℃作用20 min，即为致敏酵母多糖。

1.6.3 红细胞C3b受体花环试验

取致敏酵母多糖及红细胞悬液各50 μL，混匀，37℃水浴30 min；再加入0.25%的戊二醛25 μL，混匀，固定5 min；滴加25 μL左右样品于玻片上推片，立即烤干，滴加瑞士染液30 s～1 min，滴加缓冲液5 min，用清水清洗后，用滤纸吸干水，烤干，滴加香柏油后显微镜计数。一个红细胞结合2个或2个以上酵母菌为一朵C3b受体花环（E-C3bRR），计数200个红细胞，求出花环率。

1.6.4 红细胞免疫复合物花环试验

除使用未致敏酵母多糖外，其余步骤均与红细胞C3b受体花环试验相同。一个红细胞结合2个或2个以上酵母菌为一朵IC花环（E-ICR），计数200个红细胞，求出花环率。

1.7 数据处理方法

采用SPSS统计处理软件进行方差分析，比较组间差异显著性。花环形成百分率(%)=(红细胞花环数/200)×100%。试验数据用平均值±标准差（±S）表示。

2 结果与分析

2.1 感染APP猪血液常规指标的变化

结果见表1。

表1 感染APP猪血液常规指标的变化Table 1 Influence of infecion on the blood index of piglets with APP

由表1可知，感染APP后，猪血常规检查指标中除白细胞变化尤其显著外，其他指标变化均不显著。TG猪血液中的白细胞总数计数（WBC）、中性粒细胞计数（GRA）、中间细胞计数（MID）均较CG极显著升高（P＜0.01），但淋巴细胞计数（LYM）却较CG组极显著降低（P＜0.01）。白细胞分类计数：CG的GRA%、LYM%、MID%分别为27.1%、72.3%、0.6%，TG分别为79.2%、19.1%、2.14%；感染后传染性膜肺炎放线杆菌I型36 h血液中的GRA%、MID%值极显著增高（P＜0.01），LYM%值极显著降低（P＜0.01），呈现 GRA%与LYM%倒置。比较RBC，TG较CG略有增高，但其HGB、MCH及MCHC却较CG略有减少，但差异均不显著（P＞0.05）。

2.2 感染APP猪红细胞免疫功能的变化

C3b受体花环和IC花环见图1、图2。由表2可见，感染放线杆菌猪的E-C3bRR率和E-ICR率（X±SE）分别为15.00±3.63和12.5±2.45；CG组分别为13.75±1.58和13.75±1.58；TG的E-C3bRR率极显著高于CG组（P＜0.01），E-ICR率低于CG组，差异不显著（P＞0.05）。

图1 C3b受体花环Fig.1 E-C3bRR(×1000)

图2 IC花环Fig.2 E-ICR(×1000)

表2 感染APP猪的E-C3bRR率和E-ICR率Table 2 Influence of infecion on E-C3bRR rate and E-ICR rate of piglets with APP （%）

3 讨论与结论

3.1 感染放线杆菌猪的防御能力增强，但其免疫力下降

白细胞的主要功能是依靠其游走性、趋化性和吞噬作用等特性，来抵御和消灭入侵的病原微生物，实现对机体的保护作用[16]。一系列研究表明，机体发生急性感染时，白细胞总数往往升高[17-18]。本试验中猪感染放线杆菌I型后，白细胞总数、中性粒细胞（%）及中间细胞(%)也极显著升高，淋巴细胞(%)极显著降低，这与机体发挥其调节机能有关。感染后机体主要通过提高猪血液中性粒细胞及中间细胞（单核细胞等）的游走性、趋化性和吞噬（病原菌）功能，增强机体的整体防御机能实现对机体的保护作用；而不是通过参与机体免疫过程的淋巴细胞起主要作用，机体免疫机能下降。

正常动物每天有一定量的红细胞衰老，同时也有相应数量的红细胞和血红蛋白生成以维持动态平衡，使血液循环中的红细胞和血红蛋白数量保持相对恒定[19]。感染放线杆菌I型后，机体的RBC相对增高，但其HGB、MCH、MCHC却较略有降低，这可能与机体有一定程度的脱水及发病后食欲下降，机体同化作用减弱，合成血红蛋白减少有关。

3.2 感染放线杆菌后，猪的红细胞免疫功能及清除循环血液中免疫复合物的作用增强

红细胞是血液中数目最多的一类细胞，其主要功能是运送氧气和二氧化碳，保障机体组织和器官的正常供氧，其次是免疫功能[20]。红细胞免疫功能包括结合和运送循环免疫复合物至吞噬细胞进行清除，调控和增强吞噬细胞的吞噬功能，识别存储和提呈抗原，调控淋巴细胞应答及细胞因子的释放等，而最主要的免疫功能是清除循环免疫复合物[20]。感染放线杆菌猪的C3bRR率极显著升高，表明感染后红细胞的CR1被激活，红细胞免疫功能增强；ICR率降低，这与感染放线杆菌猪通过红细胞从循环中清除微生物、免疫复合物的作用增强，附着在红细胞表面的免疫复合物减少有关。而感染放线杆菌猪RBC相对增加，而HGB、MCH、MCHC均有下降（见表1），是否导致CR1的暴露与激活，最终引起C3bRR率极显著升高有关，有待进一步研究。

3.3 关于猪感染放线杆菌后，红细胞免疫功能增强的机理探讨

红细胞免疫是机体内重要的天然免疫组成部分，对机体免疫性疾病尤其是免疫复合物的清除发挥着重要作用[2]。红细胞与细菌、病毒等微生物免疫黏附后，不仅可通过过氧化物酶对它们产生直接的杀伤作用，而且还可以促进吞噬细胞对它们的吞噬作用(可增强4～6倍)[21-23]。

正常情况下，大多数IC进入体内后会很快与红细胞结合，并迅速被运送到肝、脾等组织加以清除，从而减少IC在组织敏感部位沉积致病。红细胞内含有高浓度过氧化氢酶（CAT）及超氧化物歧化酶（SOD），能清除吞噬过程中产生的氧化代谢产物，从而促进吞噬作用[24]。研究指出，红细胞和血清中GSH-Px活力的下降会导致IC清除障碍[25]。此外，肝、脾内过氧化物酶活性的改变同样会影响巨噬细胞功能的正常发挥，使其不能将IC有效清除[8]。感染猪的ICR率降低，可能与感染后机体调节机能增强，血清的GSH-Px含量及脾脏的SOD含量显著升高、CAT含量升高（另见报道）加速了IC的清除有关。

综上可见，感染放线杆菌猪红细胞的CR1被激活，红细胞免疫功能增强，加速了循环免疫复合物的清除。因此，感染放线杆菌猪的C3bRR率极显著升高，ICR下降。

感染放线杆菌后，猪的红细胞免疫功能及清除循环血液中免疫复合物的作用增强；机体主要通过中性粒细胞及中间细胞（单核细胞等）增强机体的整体防御机能实现对机体的保护作用。

[1] SIEGEL I,TIAN Liu-liu,NORBERT G.The red-cell immune system[J].Lancet,1981,318(9):556-559.

[2] 郭峰,钱宝华,张乐之.现代红细胞免疫学[M].上海:第二军医大学出版社,2002,6.

[3] Siegel I,Gleicher N.Red cell immune adherence(RCIA):its application in cancer and autoimmune disease[J].Immunol Commun,1981,10(4-5):433-449.

[4] 郭峰,虞紫茜,赵中丰,等.红细胞免疫功能的初步研究[J].中华医学杂志,1982,62(12)：715-716.

[5] 胡金川.红细胞免疫及其临床应用研究进展[J].国际检验医学杂志,2008,29(7):621-622.

[6] 侯海锋,包永占,李茜,等.当归对鸡红细胞免疫功能的影响[J].中国兽医杂志,2009(4):54-56.

[7] 李晓卉,殷中琼.青刺果黄酮对鸡红细胞免疫及外周血淋巴细胞免疫功能的影响[J].中国兽医杂志,2009(3):43-44.

[8] 彭西,柏才敏,李敏,等.高硒对雏鸡红细胞免疫功能红细胞总数及血红蛋白含量的影响[J].中国兽医科学,2008,38(6):535-539.

[9] 崔恒敏,彭西,黎德兵,等.高锌对雏鹅红细胞免疫功能的影响[J].中国兽医学报,2004,24(6):576-578.

[10] 刘福堂,李艳飞,顾庆云.铝中毒对蛋鸡白细胞和红细胞免疫功能的影响[J].中国畜牧兽医,2007,34(10):70-72.

[11] 黎德兵,崔恒敏,赵翠燕.鸭疫里默杆菌病发病机理的研究Ⅳ.试验感染雏鸭红细胞免疫功能的变化[J].黑龙江畜牧兽医,2007(9):61-62.

[12] 周惠萍,郭定宗,贺建忠.硒中毒对猪红细胞免疫与自由基的影响[J].安徽农业科学,2010(5):2376-2377,2380.

[13] 李清艳,翟向和,吕建存,等.附红细胞体感染对猪红细胞免疫功能的影响[J].中国兽医科技,2004,34(4):46-48.

[14] 富艳玲,王德志,王晓旭,等.中药乳膏剂对乳房炎奶牛非特异性免疫和红细胞免疫功能的影响[J].中国兽医杂志,2008,44(7):51-53.

[15] 王丽,剡根强,王静梅.绵羊自然感染附红细胞体对绵羊红细胞的影响[J].石河子大学学报:自然科学版,2006,24(1):108-111.

[16] 王建华,伍淳操.抗菌肽和蛋氨酸锌对断奶仔猪部分血液常规指标的影响[J].贵州农业科学,2010,38(3):127-130.

[17] 王岩,王久伶.急性细菌性痢疾388例分析[J]．西南国防医药,2009,19（12）:1206-1208.

[18] 卿柳庭,袁宗辉.育成猪对猪链球菌的免疫应答[J].中国兽医学报,2002,(05):47-50.

[19] 王俊东,刘宗平.兽医临床诊断学[M].中国农业出版社,2004,7:191-204.

[20] 周武,汪德清.红细胞功能检测方法的研究进展[J].中国输血杂志,2010,23(8):648-650.

[21] 薛拥志,王爱华,利凯.红细胞免疫研究进展[J].安徽农业科学,2007,35(12):3558-3560,3664.

[22] 刘景田,党小军.红细胞作为免疫细胞的事实及意义[J].深圳中西医结合杂志,2002,12(1):11.

[23] 王彩虹.红细胞免疫调控研究进展[J].中国兽医杂志,2002,38(2):28-31.

[24] KIDD M T.Zinc metabolism with special reference to its role in immunity[J].World Poult Sci J,1996,52(2):309-324.

[25] 盛永杰,陈维多.硒对奶牛红细胞谷胱甘肽过氧化物酶活力的浓度依赖性研究[J].黑龙江畜牧兽医,2001,44(8):8-9.