侧脑室注射氯胺酮降低成年SD大鼠海马区突触可塑性

郭东勇，谭 涛，田 心，王国林

（1.天津医科大学附属肿瘤医院麻醉科，天津市肿瘤防治重点实验室，天津300060；2.天津医科大学生物医学工程学院，天津300070；3.天津医科大学总医院麻醉科，天津300052）

氯胺酮（ketamine）属苯环已哌啶（PCP）类全身麻醉药,在临床麻醉中广泛应用。它既可显著抑制神经元烟碱受体功能，同时又是NMDA受体的非特异性阻断剂，这两种受体对突触可塑性长时程增强（long-term potentiation，LTP）的产生、维持和学习记忆功能至关重要[1],因此氯胺酮对学习记忆功能的影响作用越来越引起人们的关注。本实验即是对成年SD大鼠侧脑室注射氯胺酮，从电生理角度评估其对与学习记忆相关的突触可塑性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级成年SD大鼠12只，雌雄各半，由天津市放射所动物实验中心提供。大鼠在12h/12h明/暗交替、室温（23±2）℃、湿度（50±10）%的环境中喂养。

1.2 实验设计 雌雄鼠分别随机分为实验组（C-I组）和对照组（C组）。两组动物均应用20%乌拉坦腹腔注射（1.5g·kg-1）麻醉后，头部固定于大鼠立体定位仪（SN-2Narishige,Japan）。实验组经右侧脑室注射50μg氯胺酮（批号100818，福建古田药业有限公司，生理盐水稀释至5μL）；对照组经右侧脑室注射5μL生理盐水。刺激电极为自制特氟隆不锈钢双极电极(尖端直径300μm，两尖端相距约0.5mm)置于大鼠内嗅区前穿通纤维（perforant path,PP）（AP：7.5mm，L/R：4.4mm，H：3.4～4.0mm）[2]；记录电极是经电极拉制仪(P-95Heka,Germany)拉制成的尖端3～5μm、内灌2mol·L-1NaCl的玻璃电极，置于海马DG（AP：3.7mm，L/R：2.5mm，H：3.4～3.6mm）。刺激信号从刺激器（Master-8A.M.P.I，Israel）输出，经隔离器（ISO-Flex A.M.P.I,Israel）到达刺激电极，记录电极记录细胞外场兴奋性突触后电位（field excitatory postsynaptic potential,fEPSP）及突触后群峰电位（postsynaptic population spike，PPS），并输入膜片钳放大器（Axon-2B Axon,America），经数模转换器（Digidata 132x digitizer Axon,America）输入数据采集软件（Clampex 9.0Axon,America）采集并存储于计算机中。实验过程中，应用恒温系统维持动物体温（37±1）℃。

1.3 侧脑室注射氯胺酮 头顶部去毛，常规消毒皮肤，头顶部正中切口，沿颅顶中线剪开皮肤，暴露头骨及前囟，依据George Paxions&Charles Watson大鼠脑立体定位图谱，于前囟（AP）后0.8mm，中线右侧（MR）旁开1.5mm，用牙科钻钻开颅骨，微量注射器自脑表面垂直进针硬脑膜下（DV）4.0mm（AP：-0.8mm，MR：1.5mm，DV：4.0mm），于右侧脑室内缓慢注射50μg氯胺酮（生理盐水稀释至5μL）留针5min后慢慢退出。

1.4 LTP记录 正常组大鼠双侧海马均进行LTP实验。条件刺激（conditioned stimulus,CS）为波宽150μs、频率0.5Hz的恒流方波。改变刺激强度（0.15～1.0mA），测定输入/输出（Input/Output,I/O）曲线。选择诱发50%最大群峰电位（population spike, PS）幅值的刺激强度为CS强度。PS稳定（幅值变化小于10%）20min后，CS刺激并记录30min，作为基线，后行高频刺激（high frequency stimulus,HFS）（20个200Hz的脉冲为一组，间隔2s，共10组，强度为诱发75%最大PS幅值的刺激强度）。HFS后，改用CS并记录60min，观察并计算PS幅值改变情况[3]。氯胺酮组进行LTP实验时，记录基线稳定30min后，缓慢注射50μg氯胺酮（生理盐水稀释至5μL）留针5min后慢慢退出，然后重新记录基线30min后，再给高频刺激。

1.5 统计学分析 PS幅值用第一个下降相最低点到两个上升波峰连线中点距离来度量（图1）。LTP改变程度用刺激后与刺激前PS幅值百分比来反映。数据以±s表示。组间差异使用SPSS15.0经t检验进行分析，P<0.05表示在统计学上有显著性差异。

图1 在体大鼠海马PP-DG通路诱发的场电位及其测量示意图Fig 1 EPSP induced in rat hippocampal region PP-DG and measurement method of PS amplitude

2 结果

刺激大鼠海马PP，细胞外记录海马DG区PS。LTP中突触可塑性改变程度用HFS后PS幅值与条件刺激PS幅值均值之比表示。HFS后C组、C-I组PS幅值均增加且稳定，通常能持续1h以上。高频刺激后，C组PS幅值维持在较高水平：刺激后30min时为条件刺激PS幅值的（216.29±12.11）%（n=8），刺激后60min时为（202.33±11.53）%（n=8）；C-I组PS幅值在高频刺激后前5min较高，后随着时间增加有大幅减小，刺激后30min时为条件刺激PS幅值的（138.04±6.50）%（n=9），刺激后 60min时为（149.60±10.86）%（n=9），氯胺酮麻醉组LTP突触可塑性改变程度较对照组显著降低（P<0.05）（图2A、2B）。

图2 侧脑室注射氯胺酮降低成年大鼠海马区LTPFig 2 Ketamine of intracerebroventricular injection to adult SD rats reduces synaptic plasticity of hippocampus

3 讨论

氯胺酮是临床中最常用于婴幼儿的麻醉药，是NMDA受体拮抗剂，它作用于NMDA受体的PCP结合位点，缩短了NMDA受体通道的开放时间，减少了通道开放的频率，从而阻碍突触的兴奋性传递[4]。NMDA受体广泛分布于海马，对LTP效应的产生和维持有着重要的作用[5]。因而，氯胺酮可通过NMDA受体阻断各种刺激后产生的LTP效应，从而影响机体学习记忆能力[6]。

在体海马场电位记录可以完整保留海马内部以及海马与周围组织的所有神经联系，因而更能全面地反映海马的突触活动以及药物作用的真实效能，因此，在体海马场电位以及LTP记录更加受到重视，较离体脑片记录具有不可替代的生理学意义。而侧脑室注射氯胺酮可直接、快捷地非竞争性拮抗脑内NMDA受体，达到快速观察突触传递的变化及研究相关影响因素。这两种方法相结合的研究在很多文献中被应用。本实验结果显示，成年大鼠侧脑室注射氯胺酮后短时间内即可显著降低海马区LTP水平，说明侧脑室注射氯胺酮可迅速抑制海马区神经元的突触传递可塑性。杜鹃等[7]对成年大鼠侧脑室注射氯胺酮，与生理盐水组对比注药5d后对学习与记忆的影响，发现大鼠在Morris水迷宫中,学习能力与对照组相比显著下降，结果表明侧脑室注射氯胺酮可明显抑制大鼠的学习能力。

正常大鼠在体LTP记录的诱发，主要是考察立体定位仪下大鼠海马记录区域的定位准确与否，以及LTP记录相关仪器的诱发成功率情况。立体定位仪在侧脑室注射氯胺酮和海马区LTP记录中是关键仪器，整体动物的核团定位主要靠立体定位仪从三维结构插入到指定位置。实验过程中，每只大鼠都是双侧海马定位及LTP诱发及记录，但不是每侧海马都能成功记录到稳定而持久的LTP波形的。而实验中应用恒温控制系统，是为保证急性实验时动物的体温维持在正常范围内，实验结果不至于因体温变化而造成明显误差。

本实验得出侧脑室注射氯胺酮降低大鼠神经系统突触可塑性，进而影响大鼠的学习记忆功能也得到相关文献的证实，但是发生机制的研究还不明确，也已成为近期研究的热门。

［1］ Lu Y,Christian K,Lu B.BDNF:A key regulator for protein synthe sis dependent LTP and longtermmemory[J].Neurobiol Learn Mem, 2008,89（3）:312

［2］ Abe K,Fujimoto T,Akaishi T,et al.Basolateral amygdala D1-and D2-dopaminergic system promotes the formation of long-term po tentiation in thedentategyrusofanesthetized rats[J].ProgNeuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2009,33（3）:552

［3］ 谭涛,张保良,田心.寡聚体Aβ1-42对大鼠海马突触可塑性的慢性影响[J].生理学报,2011,63（3）:225

［4］ BhuttaAT.Ketamine:acontroversialdrugforneonates[J].SeminPerinatol,2007,31（5）:303

［5］ Kozek-Langenecker S A,Marhofer P,Sator-Katzenschlager S M,et al.S(+)-ketamine for long-termsedation in a child with retinoblastoma undergoinginterstitial brachytherapy[J].Pediatr Anesth,2005, 15（3）:248

［6］ Morgan C J,Riccelli M,Maitland C H,et al.Long-term effects of ketamine:evidence for a persisting impairment of source memory in recreational users[J].DrugAlcohol Depend,2004,75（3）:301

［7］ 杜鹃,王红伟.侧脑室注射氯胺酮对大鼠学习能力的影响[J].医药论坛杂志，2009，30（23）:12