有氧运动对ApoE基因缺陷小鼠主动脉脂联素受体1蛋白表达的影响

吴卫东，荆西民，岳静静

脂联素受体（adiponectin receptor，AdipoR）分为两种，脂联素受体1（AdipoR1）和脂联素受体2（AdipoR2）。现有的研究证实，在动脉内皮细胞中两种AdipoR都有表达，且动脉粥样硬化的发生、发展与血管组织AdipoR1表达下调相关，有学者称这种现象为脂联素抵抗［10］。动物实验表明［1，2］，有氧运动能有效地延缓和抑制动脉粥样硬化的发生、发展，是防治动脉粥样硬化的重要手段。运动能否通过增加主动脉AdipoR1蛋白的表达，进而提高脂联素的作用效率达到防治动脉粥样硬化的作用，相关研究鲜见报道。本研究以ApoE基因缺陷小鼠为动物模型，通过观察运动对主动脉AdipoR1蛋白表达的影响，探讨运动防治动脉粥样硬化的另一可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

8周龄雄性ApoE基因缺陷小鼠20只，购于北京大学医学部实验动物部，适应性饲养后随机分为安静组（C组，10只）和运动组（E组，10只）。两组均以二级条件饲养，饲以高脂膳食饲料（含21％脂肪，0.15％胆固醇，购于北京大学医学部实验动物部）。

1.2 运动方案

E组小鼠每日上午9：00～10：00进行跑台运动，递增运动强度和时间，每周5次，共14周。小鼠运动强度、递增运动强度、运动时间参考Fernando［6］等的研究确定。前6周由10 m/min×30 min逐渐递增至13 m/min×60 min，后8周开始稳定在13 m/min×60 min，跑台坡度为0°。

1.3 取材与指标检测

第14周末，所有小鼠处死取血，4℃3 000 rpm离心10 min，制备血清，用DEPC水进行心脏血管在体灌流，然后取出主动脉，取肾周和附睾脂肪垫放入DEPC水中冲洗表层血液，并用滤纸吸干。取材前E组小鼠停止运动48 h，禁食过夜。

主动脉病理形态观察：标本经4％多聚甲醛固定4 h后，OCT包埋，进行冰冻切片，切片厚度10μm，常规HE染色，显微镜下观察血管弹力纤维板的断裂情况。

血清脂联素含量测定：采用双抗夹心酶联免疫（ABCELISA）方法，试剂盒购自美国R＆D公司。

脂肪组织脂联素m RNA测定：RT－PCR法检测。采用Trizol一步法提取总RNA，采用两步法反转录试剂盒反转录，进行30个循环次数的PCR。引物序列检索自NCBI－Nucleotide数据库，脂联素引物扩增产物长度196 bp，上游引物：5’－AATCATTATGACGGCAGCAC－3’，下游引物：5’－CCAGATGGAGGAGCACAGAG－3’；Beta－Actin扩增产物长度511 bp，上游引物5’－CCATCTACGAGGGCTATGCT－3’，下游引物5’－CAAGAAGGAAGGCTGGAAAA－3’。

主动脉AdipoR1蛋白测定：Western免疫印迹检测。将主动脉匀浆后离心（16 000 rpm，30 min）取上清，标定蛋白浓度上样后，经12％的SDS－PAGE电泳分离。将目的蛋白转移至PVDF膜上，用5％的脱脂奶粉封闭，TBST冲洗后加兔抗鼠AdipoR1一抗4℃过夜。TBST液冲洗，加碱性磷酸酶标记的二抗孵育，NBT/BCIP显色。

1.4 统计学分析

采用SPSS 11.5数据软件包进行统计学分析，定量数据以平均数±标准差±SD）表示，两组间比较采用独立样本t检验，显著性水平P＜0.05。

2 结果

2.1 主动脉血管壁HE染色观察结果

镜下观察发现，C组小鼠主动脉血管壁纤维板分裂成多层状，出现间隙，断裂严重，内膜失去原有的波浪状，E组小鼠主动脉血管壁弹力纤维排列致密，偶有断层，内膜较完整（图1）。

图1 两组小鼠主动脉窦横截面HE染色观察图（LM×200，a为C组，b为E组）

2.2 脂肪组织脂联素mRNA表达及其血清水平

表1显示，14周实验后E组小鼠脂肪组织脂联素mRNA表达显著高于C组（P＜0.05），其血清脂联素水平同样显著高于C组（P＜0.01）。

表1 本研究两组小鼠脂肪组织脂联素mRNA表达及血清脂联素含量比较一览表

图2 脂联素mRNA表达水平示意图（M：标准DNA；E：运动组；C：安静组）

2.3 主动脉AdipoR1蛋白表达水平

表2显示，E组小鼠经过14周有氧运动后主动脉AdipoR1蛋白表达显著高于C组（P＜0.05）。

表2 本研究两组小鼠主动脉AdipoR1蛋白表达比较一览表

图3 Western Blot检测AdipoR1蛋白的表达图（E：运动组；C：安静组）

3 讨论

3.1 有氧运动通过脂联素及其受体1发挥抗动脉粥样硬化作用的可能机制

从主动脉冰冻切片的结果来看，C组小鼠主动脉血管壁纤维板分裂成多层状，出现间隙，断裂严重，内膜失去原有的波浪状。在C组小鼠主动脉血管壁纤维弹力板断裂、内膜完整性破坏后，主要位于动脉中层的通过弹力板与内膜隔开的平滑肌细胞会从中膜迁移到内膜。结果会使迁移至内膜的平滑肌细胞聚集在由坏死的泡沫细胞组成的脂池周围，由收缩型演变为合成型，产生胶原纤维和弹力纤维组成纤维帽包绕脂池形成典型的动脉粥样硬化斑块。随着病变的发展，血管会首先出现外向型重塑，主要表现为血管壁增厚并向外扩大而管腔并不狭窄。如果动脉粥样硬化斑块继续生长超过横截面积的40％，则开始出现负向重塑，血管腔出现狭窄［3］。实验结果显示，E组小鼠主动脉血管壁纤维弹力板和内膜相对C组较完好，提示，有氧运动有效延缓了动脉粥样硬化的发展。

脂联素是脂肪组织合成分泌的细胞因子，且有随内脏脂肪组织减少，基因表达水平升高的趋势，Stefan等［11］的研究证实，其在动脉粥样硬化的发病过程中发挥着重要作用。临床资料显示，脂联素与动脉粥样硬化发病的许多环节密切相关［7］，在健康人血液中含量丰富，但在动脉粥样硬化患者血液中的浓度却显著降低。本研究结果显示，E组小鼠经过14周有氧运动的训练后，脂联素的基因表达和血清水平都有显著提高，提示，E组小鼠动脉粥样硬化病变的发展要慢于C组小鼠。

脂联素要发挥作用必须通过受体的介导才能实现，动脉粥样硬化血管AdipoR显著下降，可能是导致血管损伤的原因之一。本研究发现，E组小鼠AdipoR1蛋白表达明显增加，动脉病变较C组明显改善，内膜完整性较好。分析其机制可能有：第一，运动干预同时上调了血清脂联素和AdipoR1蛋白表达，脂联素与AdipoR1结合效率提高，直接作用于血管的病变部位，抑制主动脉内皮细胞表面表达的血管粘附分子（VCAM）－1、E－选择素及细胞间粘附分子（ICAM）－1等，发挥抗动脉粥样硬化的作用［9］；第二，脂联素与AdipoR1结合可激活AMP活化蛋白激酶（AMPK），抑制糖异生相关因子的表达，增加乙酰辅酶A羧化酶的磷酸化，增强脂肪酸的氧化和葡萄糖的摄取，还可以通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα），增强脂肪酸的氧化，降低甘油三酯（TG）的浓度，有效延缓动脉粥样硬化的发展［8］。

3.2 有氧运动对AdipoR1蛋白表达影响的可能机制

本研究发现，有氧运动可以使主动脉AdipoR1蛋白表达显著增加，分析其可能机制有：1）胰岛素对Adipo R1的负性调节作用。Christiansen T［5］的研究发现，降低血液中胰岛素的水平可以使AdipoR1表达显著增加，反之，注射胰岛素可显著抑制其表达。本研究发现，经过14周的有氧运动，AdipoR1蛋白表达显著增加，这可能是有氧，的摄取和减少肝糖的异生，同时，血液中胰岛素水平降低，使Adipo R1的表达处于脱抑制的状态。2）过氧化物增殖活化受体γ（PPARγ）的调控。Chinetti等人［4］研究发现，巨噬细胞上的Adipo R受到PPARγ调控，PPARγ增加可以显著增强AdipoR的表达。有氧运动可以通过激活PPARγ的表达改善由肥胖引起的胰岛素抵抗，提高AdipoR1蛋白的表达。

4 小结

本研究表明，运动可以提高血清脂联素水平、脂联素mRNA及AdipoR1蛋白表达，从而抑制动脉粥样硬化发展的作用，这可能是运动抗动脉粥样硬化作用的另一机制。

［1］陈近利，陈吉棣.有氧运动和膳食脂肪对ApoE基因缺陷小鼠已经形成的动脉粥样硬化斑块的作用［J］.中国运动医学杂志，2001，20（3）：228－231.

［2］李则一，陈吉棣.有氧运动对ApoE基因缺陷小鼠动脉粥样硬化斑块形成的影响［J］.中国运动医学杂志，2000，19（3）：256－260.

［3］史旭波，胡大一.动脉粥样硬化发病机制的新认识［J］.临床荟萃，2006，21（24）：1751－1753.

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［11］STEFAN P，RENATE H，REINHARD M，etal.Early atherosclerosis in obese juveniles is associated with low serum levels of adiponectin［J］.J Clin Endocrinol Metabolism，2005，90（8）：4792 4796.