缝隙连接蛋白Cx43在SD大鼠电点燃癫痫模型中的表达

宋建华,谢锡驹

(1.江苏省南通市第三人民医院神经内科,江苏南通,226006; 2.南京医科大学第一附属医院普外科,江苏南京,210036)

癫痫的发病可能与兴奋性氨基酸增多、神经元缺失、胶质细胞增多、基因变异以及遗传等有密切的关系[1],而这些病变都是通过异常、过度的同步性放电来导致癫痫发作的[2]。研究发现[3],缝隙连接蛋白表达异常与癫痫间存在时间同一性。症状性癫痫病灶总是存在于具有缝隙连接的大脑灰质区;不同年龄段癫痫发作的形式与缝隙连接及缝隙连接蛋白在不同年龄段的表达程度相关[4];外伤性癫痫之所以在外伤后数月或数年后发病,与损伤的脑组织修复过程中形成了异常的缝隙连接有关[5]。这些研究均提示,缝隙连接的异常表达可能是癫痫发病的基础。本实验在制模过程中,应用特异性缝隙连接蛋白抑制剂苷酸,以及临床经验性使用预防癫痫的药物苯妥英钠进行干预,观察大鼠电点燃癫痫模型成模过程是否受到抑制,同步检测缝隙连接蛋白Cx43的表达水平,探讨缝隙连接蛋白与癫痫形成的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物:健康成年雄性SD大鼠32只,清洁级,体重220～250 g,由南通大学实验动物中心提供。自然昼夜节律光照,恒温25℃,在鼠笼内可自由获得物与水,适应性饲养3 d。主要试剂购于江苏碧云天生物技术有限公司,北京博奥森生物技术有限公司。自制双极漆包镍铬电极(直径0.1 mm)。实验平台由南通大学航海医学研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 癫痫大鼠模型:①电极植入:(前囟后3. 5 mm,旁开2.0 mm,深度2.5 mm)。②测定SD大鼠痉挛阈值。痉挛阈值确定后5 min以上就可以开始点燃实验。③雄性SD大鼠随机分为假模型组、模型组、苷酸组、苯妥英钠组。④从第4天开始假模型组、模型组予生理盐水腹腔注射(10 mL/kg),苷酸组予苷酸腹腔注射(20 mg/ kg),苯妥英钠组予苯妥英钠灌胃(100 mg/kg),均1次/d。因为32只SD大鼠的痉挛阈值范围为220～240μV。统一选定200μV作为阈值下刺激。从第4天开始,假模型组仅连接多道生理记录仪,记录脑电图,不发放刺激电流。其余3组均持续点燃2 d休息2 d,每天上、下午各点燃一次,共3周。3周后停止药物干预与电点燃。

1.2.2 痫性发作的观察与脑电图记录:根据经典的大鼠癫痫发作Racine分级判断大鼠是否有癫痫发作行为。脑电图记录:在每次点燃前5 min开始记录大鼠脑电图变化,每次记录30 min。记录参数设置为:采样率1 000 Hz,扫描速度100 ms/div,灵敏度200μV,时间常数0.2 s,低通滤波70 Hz。当出现尖波、棘波、尖(棘)慢综合波、多棘慢综合波时判定为癫痫脑电活动。

1.2.3 免疫蛋白印迹(Western blot):所有SD大鼠均于术后32 d急性断头取脑,提取海马(电极部位)蛋白,-80℃保存备用。标本收集完成后测定Cx43表达。

2 结 果

2.1 大鼠痫性发作的表现与评分

假模型组大鼠在4周内均未出现痫性发作。模型组大鼠在亚阈值刺激5 d后就出现Ⅰ～Ⅱ级发作,2周后可见Ⅳ～Ⅴ级发作,但是未见癫痫持续(SE)。干预组大鼠在10 d后出现Ⅰ～Ⅱ级发作,3周后可见Ⅲ级发作,未出现Ⅳ～Ⅴ级发作。对每只SD大鼠按痫性发作的最高级别评分0～5分。每7 d评分一次,见表1。

表1 各组大鼠不同时间点发作Racine评分比较(n=8,±s)

表1 各组大鼠不同时间点发作Racine评分比较(n=8,±s)

与模型组比较,33P<0.01

组别 7 d 14 d 21 d 28 d假模型组 0 0 0 0模型组 2.00±0.18 3.62±0.18 4.62±0.18 4.50±0.16苷 酸组2.15±0.1233 2.41±0.2233 2.28±0.1833苯妥英钠组 0 2.07±0.1433 2.59±0.2633 2.33±0.1933 0

2.2 脑电图变化

2.3 Western blot测定CX43的表达

4组两两相比,差异均有统计学意义(P< 0.01),苷酸组与苯妥英钠组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见图3-4。

3 讨 论

在癫痫的发病机制中,神经元异常同步放电成为大家所公认的原因。缝隙连接是目前发现的细胞间唯一能够直接进行物质信息交换的快通道,它可能是神经胶质细胞υ神经元信息交流的部位之一。早期研究已发现,2个相邻神经节细胞动作电位传递的间隔时间几乎为零,缝隙连接的这种直接传递,被认为是促进神经元活动达到同步化的重要原因,所以推测癫痫灶内缝隙连接在癫痫发病过程中发挥重要作用。

实验结果显示,电点燃后SD大鼠海马中缝隙连接蛋白Cx43表达明显增高,加用苷酸[6]、苯妥英钠[7]干预后,其表达增高程度受到抑制。受到干预的SD大鼠痫性发作改善,Racine分级评分降低。同步脑电图描记到的痫性电流的振幅下降。检测到的Cx43表达下降,具有同步性。苷酸是缝隙连接蛋白特异性抑制剂,作用于缝隙连接。缝隙连接蛋白受到苷酸抑制后,SD大鼠的痫性发作Racine评分降低,脑电图痫性脑电波振幅受到抑制。说明缝隙连接蛋白是痫性发作的物质基础。

图1 28 d时的脑电图A.假模型组;B.模型组;C.苷酸组;D.苯妥英钠组

图2 脑电波峰峰值比较A.假模型组;B.模型组;C.苷酸组;D.苯妥英钠组

图3 Weston blot测定的Cx43表达

图4 4组Cx43表达情况比较

胶质细胞的生理作用是维持神经元所在的内环境稳定,维护神经元的正常电活动。既往的研究发现[8],胶质细胞在癫痫的形成于发作中也扮演了重要角色。在星形胶质细胞上表达的Cx有3种[9]:Cx26、Cx30和Cx43。其中Cx43的表达量占比接近90%,推测Cx43在癫痫中的形成中占主导作用[10]。因此选择海马星型胶质细胞表达的Cx43作为检测指标。实验选择的电点燃模型与以往的其他模型比较,最大的特点是不引起神经胶质增生、坏死,神经变性等形态学变化[11-15]。实验模型SD大鼠海马区Cx43表达增加是单个胶质细胞上Cx43增加的结果。过度表达的缝隙连接蛋白在胶质细胞上组成缝隙连接。降低了相邻神经元间的电阻,降低了神经元同步放电的阈值。Cx43为什么会过度表达呢?

每一个胶质细胞都是相对独立的个体,具有一定的电容,存在一定电阻。当电流负荷超过胶质细胞最大电容时就会发生细胞膜击穿,细胞膜击穿后超负荷电流得到快速释放。在这个过程中未诱导单个细胞凋亡,没有出现胶质细胞增生改变。超负荷电流释放后,细胞膜自我修复。在点燃试验中,超负荷电流-细胞膜击穿-细胞膜修复的过程出现循环反复。只有增加细胞间缝隙连接,超负荷电流才能迅速释放,不会出现细胞膜击穿。最终诱导胶质细胞间缝隙连接增加,电阻降低,形成固定的潜在电流通路,降低了临近神经元同步放电的阈值。当痫性电流[2]出现时,就沿着固定的通路扩布。这也正是为什么癫痫的发作形式众多,但是每一个具体患者的发作形式总是相对刻板的原因。缝隙连接异常增多,形成固定的低电阻电流通道是癫痫形成的重要条件。

在癫痫形成的过程中出现的Cx43过度表达是癫痫形成的物质基础。过度表达的缝隙连接蛋白在细胞膜上组成缝隙连接,形成固定的潜在电流通路。抑制缝隙连接蛋白过度表达,阻断异常缝隙连接,癫痫形成也受到抑制。缝隙连接蛋白和异常缝隙连接是今后癫痫预防与治疗的一个有效靶点。

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