非典型应答调控蛋白活性调控机制

彭晓静，季俊杰，张玉秀，杨克迁，张红梅，朱卉

1 中国矿业大学 (北京) 化学与环境工程学院，北京 100083

2 中国科学院微生物研究所 微生物资源前期开发国家重点实验室，北京 100101

双组分信号转导系统 (Two component system，TCS) 是生物中非常保守的调控系统，横贯三域生物，通常由组氨酸激酶 (Histidine kinase，HK) 和应答调控蛋白 (Response regulator，RR) 两个组分构成。在细菌中，已报道的基因组上几乎都发现了 TCS的编码基因，且其编码基因数量更是占据细菌基因总数的1%之多[1]。TCS涉及细菌调控的许多方面，如代谢调控、磷酸吸收、厌氧/好氧生长以及复杂的发育应答等，被认为是整个原核生物信号转导系统中最具代表性的调控模式。在典型的 TCS中，编码HK和RR的基因在基因组中毗邻[1-3]，HK一般定位在细胞膜上，而RR是胞内蛋白。外界信号首先通过结合 HK膜外信号感受结构域(Sensor domain) 改变HK的构象使其自磷酸化。磷酸化的HK将高能磷酸基团传递给RR，使RR磷酸化。而磷酸化使绝大多数RR从无活性的单体转变成有活性的二聚体，并借助其输出结构域(Output domain，指DNA-binding domain) 控制目标基因的转录，从而调控一系列的细胞行为[4]。在这个“短小精干”的系统中，RR是最终的执行者，作为磷酸化控制的开关，连接外界环境信号刺激和细胞内的活动。

典型的 RR由保守的 N端 REC结构域(Receiver domain) 以及C端多变的具有DNA结合能力的效应结构域 (Effector domain) 构成。RR的REC结构域是一个β折叠片包围5个α螺旋的α/β结构，β折叠片有5个保守的氨基酸与该区域的磷酸化功能有关，包括磷酸化位点Asp57，结合Mg2+的Asp12和Asp13，与磷酸基团相互作用的 Lys109以及一个在激活机制中起直接作用的Thr87 (以典型RR CheY为例)。典型RR中，REC具有由磷酸化控制的非活性和活性两种特定的构象状态，非活性状态是单体 (个别为二聚体) 构象，当REC结构域中的保守关键氨基酸Asp57接受来自HK的磷酸基团，RR的构象发生变化，REC结构域之间利用α4-β5-α5界面的相互作用形成有活性的同源二聚体，通过构象变化调控效应结构域的DNA结合活性，引发适应外界环境改变的基因表达，从而执行一系列的下游功能[5]。RR的磷酸化最终决定该系统的信号输出，因此磷酸化是典型RR的特征。

随着相关基因组序列的公布，以及调控蛋白功能的深入研究，人们逐渐发现和认识了一类特殊的RR。这类RR并不含有整套保守的参与磷酸化功能的氨基酸，并且在基因组中不与HK毗邻。2004年，Hutchings等将这类蛋白命名为非典型应答调控蛋白 (Atypical response regulator，ARR)[6-7]。虽然 ARR的序列和三维结构与典型RR极其相似，但是到目前为止尚无一例ARR被证明可以接受磷酸基团，其功能调控机理未知。这就暗示 ARR可能存在替代磷酸化的调控机制。本研究组和谭华荣研究组合作，在国际上率先报道了 ARR结合小分子的调控机理，证明ARR调控代谢途径的终产物可以反馈调控ARR的活性[8]。以下简要概述已经报道的 ARR的结构、作用机理方面的研究进展，并以目前唯一阐明调控机理的 ARR，杰多霉素生物合成途径中的JadR1为例，剖析ARR在细菌调控过程中的作用机制。

1 非典型应答调控蛋白 (ARR)

与典型RR相似，ARR也遍布三域生物。在细菌中，其往往与细胞的生长发育、次生代谢产物合成调控以及病原菌的毒力反应紧密相关。典型 RR中磷酸化区域是控制其功能的关键要素[1-3]。RR REC结构域上5个关键氨基酸构成了接受磷酸基团的重要结构基础，如果这5个保守氨基酸中的2个被改变，RR接受磷酸基团的能力就会丧失。ARR的三维结构虽然和典型RR非常相似，但其REC结构域中缺少5个保守氨基酸中的2个或多个，而且ARR编码基因附近往往找不到相应的HK编码基因。由于ARR本身并不具备磷酸化的结构基础，推测ARR可能借助一套与磷酸化无关的调控机制调节自身活性，发挥其调控作用[9-10]。目前，在结构、聚集状态及其与活性的关系方面研究的比较清楚的 ARR主要有HP1043、FrzS、NblR等[11-13]，但对其可能的调控机制尚不清楚。

1.1 HP1043

HP1043 (HP-RR) 是 幽 门 螺 杆 菌Helicobacter pylori中hp1043编码的一个细胞生长必需的调控蛋白，调控自身和 tlpB基因的转录[12,14-15]。HP-RR周围未发现HK，是一个孤儿RR。与典型RR中OmpR/PhoB家族序列比对显示，HP-RR缺失磷酸转移所需的、位于酸性口袋的保守序列和磷酸化位点。HP-RR与启动子序列的结合不依赖于磷酸化[10]。

NMR和X-ray数据表明，HP-RR是对称的二聚体，分子拓扑结构类似于典型 RR OmpR/PhoB家族的二聚体构象。两个HP-RR单体的REC结构域利用α4-β5-α5界面形成紧密的二聚体，效应结构域通过一个复杂的连接子与REC结构域相连接。二聚体中REC结构域的三维结构类似于磷酸化后活化的 ArcA、PhoB的REC结构域，且定点突变表明 HP-RR的单体也有活性[15]。因此该二聚体构象就是 HP-RR在体内的活性构象。HP-RR的活化不依赖于磷酸化，不需要保守的磷酸化位点，是一个ARR。最近研究表明，HP-RR的表达同时受转录后和翻译后修饰水平的调控，但是具体调控的机理还不清楚[15]。

1.2 FrzS

frzS位于操纵子frzA-F的上游，其编码的蛋白 FrzS是细胞群集移动系统中的一个新元件，调控应答调控蛋白RomR的定位[16]。FrzS在细胞极与极之间转移，在决定细胞群集移动方向的一极累积[17-18]。FrzS的REC结构域缺失典型RR中传递磷酸化信号和接受磷酸基团的保守氨基酸。NMR实验表明，其不结合Mg2+和磷酸基团类似物Mg2+.BeF3。由此推测FrzS是一个ARR。

在晶体中FrzS通过α4-β5-α5界面相互作用形成四聚体和六聚体。定点突变结果表明，FrzS的REC结构域行使功能依赖α4-β5-α5界面的识别作用而非磷酸化，这进一步证明了 FrzS是一个 ARR。推测在应答调控过程中，FrzS利用α4-β5-α5界面改变蛋白构象，从而应答响应外界信号[11]。

1.3 NblR

NblR是蓝细菌细长聚球藻 Synechococcus elongatus PCC 7942在强光胁迫时藻胆蛋白的降解及营养缺乏时应答响应过程中一个必需的蛋白，但其调控的目标基因不详。在NblR的REC结构域中，Ser和 Met分别取代典型 RR中的Asp13和Thr87。虽然NblR有典型RR保守的磷酸化位点Asp57，但在体外实验中没有发现NblR被乙酰磷酸磷酸化。而且，NblR的Asp57突变株D57A的转录水平与野生型的相当，表型、抵抗外界环境胁迫的能力无明显差异[13]。因此，NblR是一个ARR。

NblR的三维结构与FrzS和HP1043的晶体结构相似，具有OmpR/PhoB家族保守的参与信号传递的α4-β5-α5界面。凝胶过滤色谱分析和酵母双杂交实验表明，无论在体外还是体内，NblR都为单体状态。因此 NblR可能与 OmpR/PhoB家族成员一样利用 α4-β5-α5界面形成有活性的二聚体[13]，但其可能采用磷酸化以外的方式控制其活性二聚体和无活性的单体状态的转换。对NblR具体的构象以及构象与调控活性之间的关系还需要进一步深入的研究。

1.4 AmiR

AmiR是一个结合RNA的转录激活调控蛋白。AmiR和AmiC组成受酰胺调控的转录反终止系统[19-21]，共同调控铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PAC1的脂肪酰胺酶的诱导表达。AmiR是第一个有结合RNA晶体结构报道的RR。AmiR的N端与典型RR的REC结构域有很高的相似性，但是缺失典型RR中保守的5个氨基酸。而且AmiR的活性受AmiC的构象变化调节而非磷酸化调节[22]。在没有小分子诱导物时，2个AmiR利用连接其N端和C端结构域的a螺旋间的coiled-coil相互作用形成二聚体，2个AmiC分子结合在AmiR二聚体的2个N端REC结构域构成“top surface”，形成不对称的复合物AmiC-AmiR。该复合物中，AmiR活性被抑制，不能结合 RNA，使得脂肪酰胺酶操纵子上游的转录产物、100 bp左右的mRNA可以形成稳定的茎环结构，导致酰胺酶操纵子的组成型转录在启动子的下游提前终止。当酰胺诱导物存在时，AmiC结合小分子诱导物，改变自身构象，释放复合物中的AmiR。AmiR形成识别特异序列的多聚体，C端结构域结合新合成的mRNA，阻止其形成茎环结构，从而防止转录提前结束[22]。因此，AmiR是一个ARR。但是，AmiR多聚体的化学性质、结构以及与特定RNA序列相互作用的结构基础还有待进一步研究。

通过对HP1043、FrzS、NblR等ARR的研究，现在对ARR的结构、聚集状态及其与活性的关系有一定的了解，但是具体的调控机制还不清楚。体外实验表明这些ARR不能被磷酸化，但是目前仍未见其机制研究的报道。ARR在链霉菌中也广泛存在，NCBI已发布至少13个链霉菌属次级代谢合成基因簇编码 ARR的基因。JadR1是目前链霉菌中调控功能和机制研究的比较清楚的 ARR，其功能分析将有助于我们理解ARR活性调控机理及其作用机制。

2 JadR1

杰多霉素是委内瑞拉链霉菌 Streptomyces venezuelae ISP5230产生的一类角蒽环芳香聚酮次级代谢产物。杰多霉素的合成需要营养压力和乙醇、热激或噬菌体感染等环境压力的刺激，是链霉菌属中唯一一例被报道在环境压力胁迫下产生的抗生素[23]，暗示其合成受到复杂的调控。序列分析表明，杰多霉素合成基因簇包含jadR2、R1、R*、W1、W2和W3 6个直接或间接参与杰多霉素生物合成基因表达调控的基因，其中JadR1是杰多霉素生物合成必不可少的调控子[24]。

jadR1位于杰多霉素合成基因簇中的第一个结构基因jadJ的上游，与jadJ转录方向相同。其全长702 bp，编码一个含233个氨基酸的蛋白，氨基酸序列比对表明其属于最大的 RR家族——OmpR家族，其C端含有结合DNA的winged HTH (Helix-turn-helix) 结构域，N端包含RR的特征结构域，REC结构域。序列比对表明，JadR1虽然具有推测的磷酸化位点Asp57，但是结合Mg2+的两个Asp分别被Glu和Ser取代。以OmpR为阳性对照，进行体外磷酸化实验，相同条件下JadR1不可以被25 mmol/L的氨基磷酸酯磷酸化。因此，JadR1应该是一个ARR。

JadR1是杰多霉素合成结构基因转录的调控子[25]，它能激活 jadJ等基因的转录，同时也能抑制自身转录。jadR1受位于其上游的jadR2产物调控。jadR2编码的蛋白JadR2抑制杰多霉素的合成。委内瑞拉链霉菌的jadR2失活突变株可以在无乙醇刺激的条件下合成杰多霉素。凝胶阻滞 (Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)实验证明，JadR2可以特异性地结合于jadR1的启动子区域。JadR2可能通过阻碍RNA聚合酶结合于jadR1的启动子区域，阻止jadR1的转录，从而间接抑制杰多霉素的合成。杰多霉素 B (Jadomycin B，JdB) 或A (Jadomycin A，JdA) 可以与JadR2结合，使其从jadR1启动子区释放，从而解除对jadR1转录的抑制[26]。

图1 杰多霉素合成基因簇Fig.1 Organizational map of jadomycin gene cluster.

图2 JadR1的结构域和保守氨基酸残基位置示意图Fig.2 The domain organization of JadR1. The amino acids corresponding to the conserved residues of typical RRs are marked.

EMSA 实验和表面等离子共振 (Surface plasmon resonance，SPR) 实验表明JadR1可以结合jadR1和jadJ的启动子区域 (PjadR1和PjadJ)。因此，JadR1通过与jadJ及其自身启动子区域的特异性结合来调控杰多霉素的合成。在前期工作中，王琳淇等通过 S1 mapping和 DNase I footprinting实验进一步确定了 JadR1结合于jadR1的上游非编码区−4到−112区域。JadR1在低浓度时结合于jadR1中结合位点较上游的区域，在高浓度时与整个启动子区域结合，阻止启动子区域结合 RNA聚合酶，从而实现对自身的负调控。JadR1结合于 jadJ的上游非编码区−27到−137，与其同源蛋白Aur1P相似，暗示JadR1很可能通过招募sigma因子对jadJ行使激活功能[8]。

王琳淇等实验证明JdB影响JadR1与PjadR1和PjadJ的结合，低浓度的JdB可以使JadR1在jadJ启动子区域上的结合更紧密；随着JdB浓度的增大，JadR1从jadJ启动子区域完全脱离。这说明低浓度JdB增强了JadR1对jadJ的激活，而高浓度JdB使JadR1丧失了对jadJ的激活功能。而对于jadR1启动子，低浓度JdB加入反应体系以后即可使得JadR1从其上游非编码区−4到−60区脱离，随着JdB浓度的增大JadR1从其本身启动子上完全脱离。EMSA实验和SPR分析表明，JdB对JadR1 DNA结合能力的影响是高度特异的，并且对之前的DNase I footprinting实验结果进行分析也发现，高浓度的发酵产物萃取物并没有在 JadR1的靶基因启动子区域形成新的空斑区，暗示 JdB可能通过直接结合 JadR1来调节JadR1的功能。JadR1是第一例被证明调控功能受到其调控代谢途径终产物调控的 ARR。不仅如此，JadR1的活性还受到其参与合成的中间产物 2,3-dehydro-UWM6、dehydrorabelomycin和JdA的调控，表明委内瑞拉链霉菌可能存在一种阶段式的自调控机制：在感受到环境中的特异信号之后，短时间内胞内相对积累的是合成的中间产物，这些中间产物可以强烈的诱导杰多霉素合成基因簇的转录，从而导致大量合成终产物JdB，当JdB积累到一定程度时，它又作为一种自调控子精密调控反馈抑制自身的合成[8]。这种调控机制的阐明对改造抗生素的调控机制，提高产量有指导意义。

3 讨论与展望

研究表明典型RR的REC结构域中5个关键保守的氨基酸是其接受磷酸基团的结构基础。但是，对HP1043、FrzS等ARR的研究发现，ARR缺失或只有部分磷酸化及其相关位点，使其不被磷酸化，这就暗示ARR可能采用不依赖于磷酸化的机制进行活性调节。

JadR1是一个OmpR家族的ARR，缺失典型RR中结合Mg2+的两个氨基酸，不可以被磷酸化，采用非磷酸化的机制调控杰多霉素的合成。我们前期实验证明JadR1是通过小分子配体介导的机制来实现其调控功能的。低浓度的JdB存在时，JadR1从自身启动子区脱离；同时，JadR2也结合JdB，从jadR1启动子区脱离，终止对jadR1转录的抑制，jadR1大量转录。大量的JadR1和低浓度JdB一起使得jadJ的转录激活得到增强，JdB开始大量合成。随着JdB浓度的逐步提高，JadR1开始逐渐从jadJ启动子上脱离，从而终止对jadJ的激活，实现对Jd B合成的精密调控。通过小分子配体介导来实现调控功能可能是典型磷酸化的一种替代方式。

图3 JadR1应答调控模式图Fig. 3 A model of JadR1 mediated regulation of gene expression.

尽管已有充分的实验证据证明 JadR1可与JdB结合，但JdB对JadR1聚集状态的影响以及JadR1调控机制的结构基础还不清楚。典型 RR的非活性状态是单体 (个别的是二聚体) 构象，当接受磷酸基团被磷酸化后，RR的构象发生变化，在REC结构域之间利用α4-β5-α5界面形成有活性的二聚体构象，然后在此构象状态下行使不同的调控功能。通过对HP1043、FrzS等ARR的研究发现，ARR可能采用一些新的构象，例如活性与非活性构象均为单体，单体和二聚体构象均有活性等不同于典型RR的构象。但是，ARR形成二聚体时，与典型RR的机理很相似，都是利用α4-β5-α5界面。通过与同源蛋白序列比对分析，推测JadR1可能也通过α4-β5-α5界面形成二聚体，但是具体构象与活性的关系还需要实验的验证。

根据DNA结合结构域的不同，链霉菌次级代谢合成基因簇中的ARR分为OmpR和NarL两个家族。JadR1是最早被研究的OmpR家族的ARR[24]。OmpR家族ARR氨基酸序列较为保守，并且其编码基因全部定位在角蒽环类抗生素或含有角蒽环类抗生素母核相似结构的次级代谢产物合成基因簇中，说明它们很可能来源于同一个祖先，并且暗示它们可能执行相似的功能。NarL家族ARR氨基酸序列不保守，其中RedZ是最早被研究的NarL家族的ARR[27]。在天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor A3 (2) 中，RedZ被认为通过激活途经特异性调控子RedD对十一烷基灵菌红素 (Undecylprodigiosin，Red) 的生物合成行使正调控[28]。RedZ不包含典型RR中保守的Asp，暗示RedZ很可能不具备接受磷酸基团的能力。王琳淇等[8]的实验表明RedZ的激活功能同样会被其调控的终产物十一烷基灵菌红素所终止，同时也说明Red对其自身的产生也存在着自调控的作用。因此，这种次级代谢终产物通过影响其合成过程中的途径特异性调控子来精细调控自身合成的方式可能是普遍存在的，不只局限于一类抗生素、一类调节蛋白，也不只适用于链霉菌，这就为一些商业化的重要的次级代谢产物产量的提高指出了新的方向。

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