铜绿假单胞菌上清液诱导J774细胞凋亡过程中Fas蛋白的表达

孟子卜，柴文戍

(辽宁医学院附属第一医院呼吸内科，辽宁锦州 121001)

铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是医院内感染最常见的致病菌，一旦感染，治疗困难。巨噬细胞是机体重要的免疫防御细胞，细菌侵袭机体组织，首先要避免被巨噬细胞等机体免疫细胞的吞噬、清除。因此激发巨噬细胞凋亡对细菌而言很重要。近来研究显示，PA以剂量依赖和时间依赖的方式诱导U937巨噬细胞凋亡，且与线粒体途径有关［1］。本研究采用J774细胞作为巨噬细胞的模型［2］，通过观察PA上清液诱导J774细胞凋亡过程中Fas蛋白的表达，进一步探讨PA上清液诱导J774细胞凋亡的致病机制，为开发新型抗感染药物提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 PA采用标准菌株ATCC27853，由辽宁医学院提供。J774细胞由中国医学科学院提供。Hoechst 33258凋亡试剂盒购自大连宝生物技术有限公司，Annexin-V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物公司，兔抗鼠Fas抗体购自北京中杉生物技术有限公司。

1.2 方法 PA用LB培养基培养，通过增菌，离心，过滤获得上清液。J774细胞置于CO2培养箱中培养。使J774细胞与PA上清液0.15的浓度混合3、6、9 h获得感染的J774细胞。采用荧光染色观察细胞凋亡形态，Annexin-V-FITC/PI双染分析测定细胞凋亡率，Western blot法测定Fas蛋白含量。

1.3 统计学分析 统计数据以SPSS 13.0软件进行分析，数据以±s表示，采用单因素方差分析进行统计学处理，两组比较采用t检验。

2 结果

2.1 荧光染色 感染3 h时，就可见到少量的凋亡细胞;6 h时，细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;9h时，产生凋亡小体。

2.2 Annexin-V-FITC/PI双染分析 对照组，实验3、6、9 h组的细胞凋亡率见Tab 1。组间比较差异均有统计学意义(P均＜0.01)。

Tab 1 Rate of apoptosis of J774(±s)

Tab 1 Rate of apoptosis of J774(±s)

＊＊P＜0.01 vs control

Time/h Annexin-V-FITC/PI/% 0 4.51±0.76 3 27.91±1.63＊＊6 42.85±2.34＊＊9 68.60±2.30＊＊

2.3 Western blot法测定Fas蛋白含量 对照组，实验3、6、9 h组Fas蛋白表达相对值见Tab 2。与对照组比较差异均有统计学意义(P均＜0.01)。

Tab 2 Relative expression value of Fas protein

3 讨论

目前对于PA感染巨噬细胞发生凋亡的信号转导途径，国内外研究还很少。已有研究显示，各种因素诱导的细胞凋亡均出现线粒体功能紊乱［3］，但是否有Fas/Fas L死亡受体途径参与目前尚不清楚。

对于Fas/Fas L死亡受体途径诱导细胞凋亡的分子机制已经进行了较深入的研究［4］。本实验通过Western blot法检测Fas蛋白，证明与Fas/Fas L死亡受体途径与PA上清液诱导J774细胞凋亡过程有关。

综上所述，PA上清液诱导巨噬细胞凋亡可能与Fas/Fas L死亡受体途径有关。因此寻找抑制Fas/Fas L死亡受体途径的药物治疗各种PA相关性疾病有着良好的应用前景。

［1］ 朱小敏，柴文戍.铜绿假单胞菌感染诱导U937细胞凋亡的研究［J］.中国病原生物学杂志，2008，3(4):263－5.

［1］ Zhu X M，Chai W S.The research of Pseudomonas aerugionsa-induced apoptosis of U937 cells［J］.China Pathog Biol J，2008，3 (4):263－5.

［2］ Zhang J L，Takayama H，Matsuba T，et al.Induction of apoptosis in macrophage cell line，J774，by the cell-free supernatant from Pseudomonas aeruginosa［J］.Microbiol Immunol，2003，47(3): 199－206.

［3］ 吴 静，杨国栋，路 红，等.D-氨基葡萄糖衍生物诱导Eca-109凋亡的机制［J］.中国药理学通报，2008，24(1):33－6.

［3］ Wu J，Yang G D，Lu H，et al.Effect of derivatives of D-aminoglucose on the reactive oxygen species and mitochondrial membrane ptoential change of Eca-109 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(1):33－6.

［4］ Gehring S，Rottmann S，Menkel A R，et al.Inhibition of proliferation and apoptosis by the transcriptional repressor Mad1.repression of Fas induced caspase 8 activation［J］.J Biol Chem，2000，275 (14):10413－43.