高效液相色谱法测定参芪补气片中黄芪甲苷的含量

颜海弟，谭丽容，陈 越，何景进，李楚文，吴典伟，苏子仁#(.广东省湛江市第二人民医院，广东湛江54008;.广州中医药大学，广州 50006)

参芪补气片是应用多年、疗效确切的制剂品种，由黄芪、人参等组成，具有补气固表等功效，用于元气不足、表虚不固等症。黄芪甲苷为参芪补气片的主要有效成分之一，为有效控制本制剂的质量、保证其临床疗效，本研究以黄芪甲苷作为质量控制指标，建立参芪补气片的质量控制方法。《中华人民共和国药典:一部》(2010年版)中，黄芪甲苷作为黄芪质量控制的指标成分，其中规定的测定黄芪甲苷的方法为HPLCELSD［1］，但此方法采用质量检测器、仪器设备不通用，样品中其他组分干扰大，因此本实验采用柱前衍生化法对制剂中黄芪甲苷进行含量测定，结果报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Dionex Summit高效液相色谱仪(P680 HPLC Pump，ASI-100 Automated Sampled Injector，UVD170U，STH585 Column Oven)，Chromeleon 6.70数据处理系统。

1.2 试药

黄芪甲苷对照品(含量测定用，批号110781-200913)，购自中国药品生物制品检定所;乙腈为色谱纯试剂(购自Merck公司)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。参芪补气片(批号:20111201、20111203、20111205，由广州中医药大学新药开发研究中心提供)，每片重0.64 g。缺黄芪的阴性样品:模拟参芪补气片制备工艺，制备除黄芪外其他药材和辅料的阴性样品(由广州中医药大学新药开发研究中心提供)。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品储备液:分别精密称取黄芪甲苷对照品9.63 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.195 mg·mL－1的储备液。

2.1.2 对照品溶液:精密量取对照品储备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4、1.8、2.0、2.5 mL，先后加吡啶1 mL、氯仿2 mL，在冰浴下加入苯甲酰氯0.5 mL，摇匀后于冰箱中4℃放置24 h，使衍生化反应完全。挥干溶剂，残渣用甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中，微孔滤膜过滤，即得［2］。

2.1.3 供试品溶液:取同一批号样品适量，除去包衣，研细，每份称取约0.5 g，精密称定，加甲醇100 mL索氏提取4 h，蒸干，残渣加水饱和正丁醇20 mL溶解，用1%氢氧化钠溶液振摇提取3次(每次6 mL)，弃去碱液，正丁醇液用正丁醇饱和水洗涤2次(每次6 mL)，弃去水层，正丁醇蒸干，残渣加1 mL吡啶溶解，加入氯仿2 mL，在冰浴下加入苯甲酰氯0.5 mL，摇匀后于冰箱中4℃放置24 h，使衍生化反应完全。挥干溶剂，残渣用甲醇稀释并定容至10 mL量瓶中，微孔滤膜过滤，即得［3］。

2.1.4 阴性样品溶液:取缺黄芪的阴性样品，按“2.1.3”项下操作，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱:Phenomenex Gemini C18柱(50 mm×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈∶0.1%三乙胺溶液(95∶5)等度洗脱35 min;流速1.0 mL·min－1;检测波长270 nm;柱温20℃;进样量10 μL。理论板数按黄芪甲苷峰计算不低于3 000。在上述色谱条件下，黄芪甲苷能达到基线分离，阴性无干扰，专属性强。色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图Fig 1 HPLC chromatogramsA.衍生化对照品;B.衍生化样品;C.衍生化阴性样品;a.黄芪甲苷A.reference substance after derivatization;B.sample after derivatization; C.negative sample without Radix Astragali after derivatization;a.astragalosideⅣ

2.3 线性范围考察

按“2.1.2”项下方法制备对照品溶液，分别进样测定。以进样量X对黄芪甲苷峰面积Y进行线性回归，得标准曲线方程。结果表明黄芪甲苷进样量在0.078～0.975 μg内呈良好的线性关系，回归方程为:Y=5.503×103X－25.277(r= 0.999 9)，见表1。

2.4 精密度试验

精密量取对照品溶液10 μL注入色谱仪，测定峰面积。结果表明连续进样7次的峰面积平均值为2 061.365，RSD= 0.71%，显示精密度良好，见表2。

表1 线性范围考察试验结果Tab 1 Linear range of astragalosideⅣ

表2 精密度试验结果Tab 2 Result of precision test

2.5 稳定性试验

精密吸取供试品溶液10 μL，分别在0、2、4、6、8、10、12 h注入色谱仪，测定峰面积，求得RSD＜2.0%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定，见表3。

表3 稳定性试验结果Tab 3 Results of stability test

2.6 重复性试验

取同一批样品按“2.1.3”项下方法操作，平行制备供试品溶液6份，测定峰面积并计算含量。结果样品中黄芪甲苷含量平均值为0.53 mg·片－1，RSD=0.82%，表明该方法重复性好，见表4。

表4 重复性试验结果Tab 4 Results of repeatability test

2.7 回收率试验

取同一批样品9份，每份约0.25 g，精密称定，分别精密加入对照品适量(约为样品中黄芪甲苷含有量的0.8、1.0、1.2倍)，按“2.1.3”项下方法操作，测定峰面积，计算含量，求得加样回收率平均值为 99.51% ～100.76%，RSD=0.29% ～1.11%。结果表明该方法准确度高，见表5。

2.8 样品测定

取3个批次的参芪补气片各3份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行测定，用标准曲线法计算黄芪甲苷的含量。将本文的柱前衍生化-HPLC法与《中华人民共和国药典》(2010年版)的HPLC-ELSD法［1］测定结果的平均值进行比较，见表6。

表5 回收率试验结果Tab 5 Results of recovery test

表6 样品含量测定结果(，n=3)Tab 6 Results of content determination of samples(，n=3)

表6 样品含量测定结果(，n=3)Tab 6 Results of content determination of samples(，n=3)

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3 讨论

作为药材黄芪的标志性成分，黄芪甲苷仅在近紫外区200 nm末端有弱吸收，同时中成药制剂成分相对复杂，干扰组分一般较多。采用HPLC法对其进行含量测定，若配置常规的紫外检测器，实验精密度、准确度往往比较低。《中华人民共和国药典:一部》(2010年版)规定的测定黄芪甲苷的方法为HPLCELSD［1］，但ELSD作为检测器，对于黄芪甲苷的检测限灵敏度较低(0.1～10 μg)［4］，同时ELSD价格比较昂贵，应用范围较紫外检测器窄，故不适合黄芪甲苷的含量测定分析。

衍生化技术可通过化学反应将样品中难于分析检测的目标化合物定量的转化成另一易于分析检测的化合物，通过后者的分析检测对目标化合物进行定性和(或)定量分析。本试验采用柱前衍生化-HPLC法，对黄芪甲苷分子中的羟基进行苯甲酰化反应，接上强紫外吸收基团，生成产物最大吸收波长红移至UV270 nm;同时，在该检测波长下，其他成分的干扰也明显减少，提高了分离选择性和检测灵敏度。采用本法进行黄芪甲苷的含量测定分析，仪器通用性较强，适合于绝大多数HPLC的仪器配置。

实验结果表明，参芪补气片采用柱前衍生化-HPLC法测定黄芪甲苷的含量，样品处理简便，检测灵敏度提高，专属性强。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［S］.2010年版.北京:化学工业出版社，2010:283.

［2］ 朱 蕾，王竹天，杨大进.关于保健食品中黄芪甲苷含量测定的研究［J］.卫生研究，2009，38(2):203-204.

［3］ Asan A，Isildak I.Determination of major phenolic compounds in water by reversed-phase liquid chromatography after precolumn derivatization with benzoyl chloride［J］.J Chromatogr A，2003，988(1):145-149.

［4］ Lin X，Xu DS，Feng Y，et al.Determination of Ophiopogon japonicus polysaccharide in plasma by HPLC with modified postcolumn fluorescence derivatization［J］.Anal Biochem，2005，342(2):179-185.