反相离子对高效液相色谱法用于利塞膦酸钠有关物质的分离与测定

张卫民，杨 杰，吴拥军

(1.河南天方药业股份有限公司，河南驻马店 463000;2.郑州大学化学系，河南郑州 450001)

0 引言

利塞膦酸钠是由美国宝洁公司研制开发的第三代双膦酸盐类药物，为西药二类新药。到目前为止，只开发出少数测定生物基质中利塞膦酸钠的分析方法，包括经酰化和硅烷化形成挥发性衍生物后的气相色谱—质谱法［1］和非常灵敏但极为复杂的酶联免疫吸附测定法［2］。据文献报道，高效液相色谱法是测定利塞膦酸钠的首选方法［3－5］。本文介绍一种用于双膦酸盐类药物利塞膦酸钠与有关物质分离的反相离子对高效液相色谱法，该方法操作简便、准确可靠。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

戴安高效液相色谱仪，美国戴安公司;100 μm Hamilton微量进样器，美国;移液枪，Dragon，芬兰;AL 104型电子天平，梅特勒—托利多仪器有限公司。塞膦酸钠原料药(批号:071100010)由河南天方药业公司提供，利塞膦酸钠化学对照品(批号:100613－200401)购自中国药品生物制品检定所。

1.2 色谱条件

通过测试不同流动相pH值、四丁基溴化铵浓度、甲醇比例、磷酸二氢铵浓度和乙二胺四乙酸二钠浓度对利塞膦酸钠及其有关物质色谱行为的影响，确定了如下色谱条件:色谱柱为美国Thermo BDS Hypersil C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇—水(25 ∶75，体积分数)，流速为0.8 mL/min，柱温为30℃，检测波长为262 nm。

1.3 利塞膦酸钠原料药有关物质限量检查

采用不加校正因子的主成分自身对照法，溶液配制及有关物质HPLC测定方法参照2010版中国药典附录 VD［6］。

2 实验结果

2.1 流动相组成的优化

经过多次实验，得到优化后的流动相组成为:pH值为7.9，四丁基溴化铵浓度为2 mmol/L，甲醇比例为25%，磷酸二氢铵浓度为5 mmol/L，EDTA浓度为1.5 mmol/L时，二者出峰时间较为合适且能达到良好的分离。

2.2 利塞膦酸钠有关物质测定

在上述色谱条件下，1 g/L利塞膦酸钠与其有关物质均能分离，4.941min的峰为流动相的峰，利塞膦酸钠与其有关物质的保留时间分别约为5.9 min 和8.3 min，分离度大于 2.5，见图 1;理论塔板数以利塞膦酸钠和有关物质峰计分别不低于5 000和2 000。利用有关物质供试溶液和对照溶液分别重复进样5次的实验结果，即得有关物质的峰面积为0.326、0.328、0.346、0.282、0.326，利塞膦酸钠的峰面积为:2.208、2.207、2.252、2.216、2.245。因此二者相对标准偏差RSD分别为7.4%和0.96%。

图1 1 g/L利塞膦酸钠溶液色谱图

表1 对照和供试溶液中利塞膦酸钠及其有关物质的峰面积

根据表1的测定结果，以不加校正因子的主成分自身对照法计算，杂质峰含量约为0.14%;同时以面积归一化法对供试品溶液色谱图中杂质峰和主成分峰峰面积计算，杂质峰含量也约为0.14%，两种计算方法得到的结果较为一致。

3 讨论

本文所建立的反相离子对HPLC分析方法在测定利塞膦酸钠时重现性好，利塞膦酸钠及其有关物质能达到良好分离，方法系统适用性好，在有关物质检查时得到的结果较为可靠。因此利用该法，可以用于利塞膦酸钠常规分析及其有关物质检查，同时为利塞膦酸钠原料药的质量控制提供了有效可靠的分析手段。

［1］Auriola S，Kostiainen R，Ylinen M，et al.Analysis of(dichloromethylene)bisphosphonate in urine by capillary gas chromatography－mass spectrometry［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，1989 ，7(12):1623－1629.

［2］Mitchell D Y，Heise M A，Pallone K A，et al.The effect of dosing regimen on the pharmacokinetics of risedronate［J］.Journal of Clinical Pharmacology，1999，48(4):536－542.

［3］李朋梅，张 明，张 镭，等.利塞膦酸钠片溶出度测定方法的建立［J］.中国药房，2011，22(33):3137－3138.

［4］杨 杰.利塞膦酸钠原料药中有关物质的鉴定及其溶解度研究［D］.郑州:郑州大学，2010.

［5］万维香，瞿建江.高效液相色谱法测定利塞膦酸钠的含量［J］.中国药业，2010，19(4):24－25.

［6］国家药典委员会.中华人民共和国药典二部［M］.北京:化学工业出版社，2010，附录31页.