人巨细胞病毒感染人源细胞后的蛋白质检测

杨海青，朱剑梅，邱发麒，邓成莲，何英，游传蓉

(四川省医学科学院·四川省人民医院城东病区内一科，四川 成都 610101)

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)属疱疹病毒科，是一种常见的机会性感染病原体，在成人中的感染率可达90%，其中绝大部分为“健康带毒状态”，即血清中可检测到抗HCMV-IgG阳性，但无相关病毒疾病症状出现［1］。初始感染后，病毒基因组进入单核细胞并潜伏。免疫机能低下的状态时，如获得性免疫缺陷综合征(AIDS)和器官移植后使用免疫抑制剂的患者，HCMV可再次活化并导致严重的CMV疾病。

HCMV在体内可感染多种细胞，包括成纤维细胞、内皮/上皮细胞、平滑肌细胞、单核/巨噬细胞、中性粒细胞，但只能在少数细胞内成功复制并产生有感染力的病毒，包括单核/巨噬细胞、成纤维细胞及内皮细胞［2］。感染过程是衣壳蛋白参与病毒与细胞膜的融合，使病毒核衣壳进入胞浆，DNA-蛋白质复合物进入核孔［3］。正常状态下，病毒基因组整合于细胞基因组内并随细胞DNA复制，形成长期潜伏感染状态。在免疫低下状态时，病毒DNA复制并在细胞内装配成成熟的病毒颗粒，通过内质网运输到细胞表面，释放到细胞外。在HCMV感染宿主细胞中，衣壳蛋白B(glycoproteinB，gB)起重要作用，可与细胞膜融合，并与衣壳蛋白gH、gL形成三聚体，还与细胞膜表面手体(整联蛋白α2β1、α6β1和αVβ3)结合，完成感染［4］。

本研究选用人间充质干细胞(human marrow stromal cell，HMSC)、人胚成肌细胞(humanembryomyoblasts，HEM)、人皮肤成纤维细胞(human demal fibroblasts，HDF)，检测其对HCMV的易感性，并通过Western-blot的方法检测感染后蛋白质的表达情况。

1 材料与方法

1.1 病毒珠及细胞培养 HCMV病毒珠购自ATCC(VR-807)。所使用的人源细胞为 HMSC、HEM、HDF，用DMEM培养基培养(含10%新生小牛血清、2 mM谷维酸、1 mM丙酮酸钠、100 U/ml青霉素及链霉素)，所有细胞2～3天换液一次。

1.2 HCMV感染靶细胞 HCMV病毒上清由MRC-5细胞产生。为去除细胞碎片，将上清离心(3000 rbm，30 min)，将HMSC、HEM和HDF按1× 106/瓶接种;第二天接病毒上清接种细胞，感染2小时后用无血清DMEM洗细胞两次，加入完全培养基培养。

1.3 蛋白质提取 在感染后3、7、10天收集感染后的细胞及对照细胞，计数后离心(1500 rpm，5 min);用PBS洗细胞一次(1500 rpm，5 min);将离心后的细胞放置冰上，并配置蛋白质裂解缓冲液(500 μl RIPA，0.5 μl PMSF和1/2片蛋白酶抑制剂)，并混匀;按10 μl/L million加入裂解缓冲液，涡旋混均后放置冰上15 min，且每5 min涡旋混均一次;离心沉淀(14000 rpm，15 prm，4℃);收集上清并用牛血清白蛋白测定蛋白质浓度后储存-80℃。

1.4 蛋白质印迹

1.4.1 电泳 将一次性SDS-PAGE凝胶放于电泳槽中;每孔加入20 μg提取的蛋白质，加入4 μl 4×l aemmli缓冲液，并用RIPA缓冲液补齐体积至20 μl;100℃或沸水浴加热3～5分钟，以充分变性蛋白。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分量分子量大小，还加入预染蛋白质分子量标准(Marker);用1×Tris-glycine-SDS电泳液加满电泳槽后电泳(80 V，2.5 h)。

1.4.2 转膜 将准备好的醋酸纤维素膜预先浸泡于转膜缓冲液中(包括100 ml 10×TBS缓冲液，200 ml甲醇，700 ml水);将电泳好的凝胶放于醋酸纤维素膜上后有转膜(300 mA，2 h);转膜完成后用丽春红或考马斯亮蓝染色，以观察转膜效果。

1.4.3 封闭 转膜完成后，加入100 ml TBST封闭液(含5%脱脂奶粉和1%牛血清白蛋白)，4℃震荡过夜。

1.4.4 抗体孵育 封闭完成后，用蛋白质洗涤缓冲液1×TBST(含5%Tween-20)洗3次(5 min/次)后加入用封闭缓冲液的一抗(鼠抗人CMVpp65单克隆抗体，Millipore，5097R);4℃震荡过夜。用100 ml蛋白质洗涤缓冲液1×TBST(含5%Tween-20)洗膜5次，5 min/次;按1︰2000加入二抗(辣根过氧化物酶标免抗鼠IgG)，室温震荡1 h;100 ml洗涤缓冲液洗膜5次，5 min/次。

1.4.5 显色 用ECL化学发光试剂盒，将试剂1和2按1︰1混合，室温下显色5 min后进入暗室曝光(曝光时间分别为:30 s和1、2、3、5 min，以寻找最佳曝光时间)。

2 结果

HCMV感染人源靶细胞3天后，已可以检测到CMV特异性蛋白质。在HEM的检测中，观察到在感染后第3、7、10及14天，CMV-pp65的表达是没有变化的(图1)。人胚软骨的检测中，感染后第3天可检测到较强的CMV蛋白质表达;但在感染后第7天，发现CMV表达已下降到无法检测到的水平;感染后第10天和第14天，又重新检测到CMV-PP65高表达，并且表达强度超过第3天，表明在感染后两周，CMV在人胚软骨中的表达更高(图2)。在HMSC的感染检测中，发现在感染后第7、10、14天的CMV-pp65蛋白质表达水平相当，而且均高于感染后的第3天，同时发现出现另外一条蛋白质带，其原因可能是由于抗体的非特异结合，或者该细胞在表达中表现另外一个CMV-PP65蛋白质亚型，具体原因需通过进一步实验室验证。

本实验中，为避免蛋白质总量不一致所造成的误差，特采用β-actin为内参照，结果表明所加入的蛋白质无显著差异。

图1 CMV感染人胚成肌细胞后的蛋白质表达检测N-阴性对照(未感染的人胚成肌细胞)

图2 CMV感染人胚软骨细胞后的蛋白质表达检测N-阴性对照(未感染的人胚软骨细胞)

图3 CMV感染人间充质干细胞后的蛋白质表达检测N-阴性对照(未感染的人间充质干细胞)

3 讨论

迄今为止对人类健康造成危害的病原体中，HCMV感染占重要地位。CMV具有典型的疱疹病毒形态，其DNA结构也与HSV相似，但比HSV大5%［5］。CMV对宿主或培养细胞有高度的种特异性。HCMV可用人胚肌皮、肺、睾丸等的成纤维细胞分离或培养细胞。一般认为只有分化细胞才是CMV的容许细胞，未分化或者转化细胞是非容许细胞，在非容许细胞中，病毒基因不表达［6］。

HCMV初始感染宿主后，病毒基因组进入单核细胞并潜伏。应用敏感的PCR技术可在健康携带者的外周血单核细胞中检测到病毒DNA，提示单核细胞为病毒持续存在的位点之一。HCMV与单核细胞、巨噬细胞和组织细胞的相互作用可能是引起病毒持续和潜伏感染的主要原因(医学分子病毒学)。近年大量的实验结果证实，HCMV的致病机理为诱细胞周期蛋白和细胞周期相关激酶的高水平表达，刺激细胞的有丝分裂，从而诱导原癌基因的表达或表达增高，以这种方式干扰细胞的调控机制尤其是干扰细胞增生、分化的调控，使细胞恶性变;同时HCMV感染的细胞中，肿瘤抑制蛋白p53蓄积增加，HCMV IE2能与其结合并抑制报告基因的转录，IE2蛋白还能结合另一个与细胞周期调控有关的肿瘤抑制蛋白PRB，因此HCMV感染既损伤了抗癌基因产物的功能，又刺激了原癌基因的过度表达，直接参与了细胞的恶性变过程［7，8］。

在本研究采用三种未转化的人源原代细胞，包括HMSC、HEM和人胚软骨细胞，研究CMV是否会感染这三种原代细胞，以及感染后不同时间病毒蛋白质的表达情况，结果发现CMV可成功感染这3种原代细胞，并在感染后不同时间段均表达病毒蛋白，表明CMV在这3种细胞中处于活化状态。但CMV对这3种细胞的致病情况仍待研究。

［1］Wei Wang，Ping Yu，Peng Zhang，et al.The infection of human primary cells and cell lines by human cytomegalovirus:new tropism and new reservoirs for HCMV［J］.Virus research，2008，131:160-169.

［2］Revello MG，Gerna G.Human cytomegalovirus tropism for endothelian/epithelian cells:scientific background and clinical implications［J］.Rev Virol，2010，20:136-155.

［3］Vanarsdall AL，Ryckman BJ，Chase MC，et al.Human cytomegalovirus glycoprotein gB and gH/gl mediate epithelial cell-cell fusion when expressed either in cir or in trans［J］.J Virol，2008，82(23):11837-11850.

［4］Feire AL，Koss H，Compton T.Cellular integrins function as entry receotor for human cytomegalovirus via a highly conserved disintegrinlike domain.Proc.Nat.Acad［J］.Sci，2004，101:15470-15475.

［5］金奇.医学分子病毒学［M］.北京:科学出版社，2001.

［6］Michaelis M，Doerr HW，Jindrich CJ.Oncomodulation by human cytomegalovirus:evidence becomes stronger［J］.Med.Microbiol［J］.Immunol，2009，198:79-81.

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［8］Tabata T，Kawakatsu H，Maidji E，et al.Induction of an epithelial integrin alphaveta6 in human cytomegalovirus-infected endothelial cells leads to activation of transforming growth factor-beta 1 and increased collagen production［J］.Am J Pathol，2008，172:1127-1140.