人羧酸酯酶1结构和功能的研究进展

童金英，易银沙，曹蓬荣，刘彩云，王雷，吕媛

1 湖南师范大学医学院，湖南长沙 410006

2 长沙赢润生物技术有限公司，湖南长沙 410013

人羧酸酯酶(Human carboxylesterase)是丝氨酸水解酶多基因家族的重要成员之一，属于B族酯酶。该酶与多种药物、前体药物、环境毒物及致癌物的解毒和代谢有关，能有效催化羧酸酯类、氨甲酸酯类、酰胺类、硫酯类等外源性物质的水解[1-2]。人羧酸酯酶主要包括人羧酸酯酶1(Human carboxylesterase 1,HCE1)和人羧酸酯酶2(Human carboxylesterase 2,HCE2)，分别由ces1和ces2基因编码，两者的氨基酸序列同源性为48%，在组织分布及底物特异性方面存在着较大的差异[3-5]。HCE1为肝羧酸酯酶，主要分布于肝脏，其在胃肠道含量较低；HCE2为肠羧酸酯酶，主要分布于胃肠道，特别是小肠中其含量极为丰富[6]。HCE1容易催化含较小醇基和较大酰胺基底物的水解，如哌醋甲酯(Methylphenidate)、奥司他韦(Oseltamivir)等药物；相反，HCE2更容易催化含较大醇基和较小酰胺基底物的水解，如可卡因(Cocaine)、伊立替康(Irinotecan)等药物[5,7]。HCE1是一种参与肝脏外源物质解毒及药物代谢的羧酸酯酶，但HCE1除了在药物、毒物代谢方面发挥重要作用外，还能参与人体内胆固醇酯和游离脂肪酸的运输和代谢过程[8-9]，是肝细胞肝癌早期诊断的一种良好的血清学标志物[10-11]。文中从HCE1的结构、药物代谢、毒物代谢、脂质代谢及肝细胞肝癌早期诊断等功能方面，综述了近十年来HCE1的相关研究进展，为深入研究HCE1的功能，特别是药物代谢上的性质与功能打下基础，同时也为肝细胞肝癌的早期诊断试剂的研发提供参考。

1 HCE1结构和分布

在1993年，人ces1基因的cDNA 及全长序列是由Kroetz 等[12]和Shibata 等[13]分别首次从人肝λgt11文库、人外周血细胞基因组DNA 文库克隆出来的。ces1基因定位于人染色体上16q22.2，全长30313 bp，含有14个外显子。该基因在选择性剪切的过程中可产生3种mRNA亚型：亚型a (RefSeq ID：NM_001025195.1)、亚型 b (RefSeq ID：NM_001025194.1)和亚型c (RefSeq ID：NM_001266.4)，分别可编码含568、567、566个氨基酸残基的 N-连接糖蛋白(N-linked glycoprotein)，相对分子量大小约为62 kDa 。通过查询 GeneCards 数据库(http://www.genecards.org)和NCBI SNP 数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)发现，人ces1基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)记录已有836条，其中非编码序列区的SNPs 约占83%，另外可引起编码区氨基酸置换的SNPs 有76个，其中较为有临床意义的2个 SNPs 分别是 p.Gly143Glu 和p.Asp260fs[14]。p.Gly143Glu 是指ces1基因编码序列的第4外显子第143位的甘氨酸突变成谷氨酸(GGG→GAG)，为一种错义突变，但其仍可以翻译出567个氨基酸。Gly143Glu 的小等位基因突变频率在白人、黑人、西班牙人、亚洲人群中的分布分别为3.7%、4.3%、2.0%和0.0%。p.Asp260fs 指ces1基因编码序列的第6外显子中第260位密码子的最后一个核苷酸有一碱基缺失(GAT→GA-G，T/−)，可导致第260～299位氨基酸发生移码突变，即引起后续39个氨基酸错误翻译，同时可导致其翻译过程提前终止，造成未成熟终止密码子，仅翻译出298个氨基酸。p.Asp260fs 在人群中的分布极为少见。

HCE1蛋白由催化中心结构域、α/β结构域、调节区结构域，其中催化中心结构域含有酶活化位点催化中心，而调节区结构域包含低亲和性的配体结合部位——“Z-site”。HCE1蛋白含有羧酸酯酶家族共有特征性序列，如活化部位氨基酸残基三联体(Ser221、Glu354和His468)、微粒体导向序列[包括N-端疏水性信号肽序列和C-端内质网滞留序列(His-Ile-Glu-Leu，HIEL)]、2对二硫键形成的氨基酸残基(Cys87/Cys116和Cys274/Cys285)、配体结合部位[包括“Z-site”(Gly356)、“side door”(Val424-Met425-Phe426)和“gate”(Phe550)]等[1]。其中，“Z-site”和“side door”分别可结合胆固醇和脂肪酸类似物，“gate”可释放所结合的底物，N-糖基化位点(Asn79-Ala80-Thr81)在维持酶的稳定性及最大酶催化活性功能中可发挥重要作用[15]。C-端内质网滞留序列(His-Ile-Glu-Leu,HIEL)可结合到内质网内腔膜上的HIEL 受体，与HCE1在内质网内腔的滞留及酶的分泌功能有关[16]。HCE1在内质网内腔膜上的定位主要依赖于其蛋白N 端的18个疏水性氨基酸信号肽，该信号肽有助于HCE1通过内质网进入血循环进行运输，可与β-葡糖醛酸糖苷酶(β-glucuronidase)形成复合体，以促进第二相药物的催化水解[16]。

HCE1是主要由肝脏组织合成和分泌的一种N-连接糖蛋白，可通过内质网和高尔基体分泌到血液循环中[17]。HCE1主要定位于肝脏微粒体和肝细胞质中，该酶在肝组织中的表达水平与年龄呈正相关，即随着年龄的增大，其肝脏内HCE1的表达水平则越高[18]。早期的研究中发现，HCE1高表达于单核细胞/巨噬细胞、肺巨噬细胞、肺上皮细胞中[19]。另外，HCE1在脑、胃、睾丸、肾、脾、结肠等组织中亦可见少量表达[4,17]。

2 HCE1的药物代谢功能

HCE1是一种很重要的肝药物代谢酶[2]，该酶能有效水解含有酯键、酰胺键、硫酯键的外源性药物或前体药物，例如血管紧张素转换酶抑制剂(替莫普利Temocapril，咪达普利Imidapril，地拉普利Delapril)、抗癌药(伊立替康Irinotecan、卡培他滨 Capecitabine)、麻醉剂(可卡因Cocaine、海洛因Heroin、哌替啶Pethidine)等药物[20]。HCE1可以将抗结肠癌药物——伊立替康(Irinotecan,CPT-11)激活为药物活性代谢产物——SN-38(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin，拓扑异构酶Ⅰ抑制剂)。由于HCE1在人肝脏组织中的含量十分丰富，它可负责肝脏内50%伊立替康的代谢激活反应[21]。但目前体外研究[22]表明，伊立替康的药物代谢激活主要依赖于HCE2的酶活性，HCE2对于伊立替康的代谢激活能力显著高于HCE1。人体内十二指肠、空肠、回肠、肾等组织中约99%以上的伊立替康的生物转化反应均由HCE2负责[21]。HCE1在体内血管紧张素转换酶抑制剂药物的代谢过程也发挥着重要作用，HCE1可将其激活为活性代谢产物。如替莫普利(Temocapril，药物前体)可被HCE1激活，产生有活性的血管紧张素转换酶抑制剂——替莫普利拉(Temocaprilat)[23]。Zhu 等[24]以野生型基因ces1(Wild type,WT)和2种基因突变型——p.Gly143Glu 和p.Asp260fs 分别转染Flp-In-293细胞以表达相应的酶，发现野生型酶可有效催化群多普利(Trandolapril)为活性产物——群多普利拉(Trandolaprilat)，而携带有p.Gly143Glu 和p.Asp260fs 突变的基因可导致表达的酶失活，使其不能有效对群多普利进行催化水解。由此，我们可以看到人ces1基因的突变与药物的代谢异常有密切的关联。

奥司他韦(Oseltamivir)是一种强效的选择性的流感病毒神经氨酸酶抑制剂，主要用于由甲型或乙型流感病毒引起的流行性感冒的治疗和预防，是HCE1的特异选择性底物[25]。HCE1可以将奥司他韦激活为活性代谢产物——奥司他韦羧化物(Oseltamivir carboxylate)，但若HCE1酶活性缺失，可能导致奥司他韦不能发挥很好的临床疗效。Zhu 等[26]报道，转染野生型基因ces1的Flp-In-293细胞和人类肝组织的S9组分均能快速催化奥司他韦为活性代谢产物，携带有基因突变p.Gly143Glu 和p.Asp260fs 的酶催化活性却显著下降，其中携带p.Gly143Glu 的酶最大水解速率仅有野生型酶的25%，而携带p.Asp260fs的酶不能检测到药物催化活性。Shi 等[27]也发现携带ces1基因Cys87Phe 和Arg199His 位点突变的个体其HCE1对于奥司他韦的酶水解速率显著下降，而携带ces1基因Ser75Asn 位点突变的个体其HCE1对奥司他韦的水解活性则可提高约25%。这表明人ces1基因的突变可影响HCE1对奥司他韦的水解活性，这对于评价奥司他韦的临床疗效、耐受性及毒性等方面有着重要的指导意义[28-29]。随着年龄的增长，HCE1的表达水平和酶活性也会随之变化，Yang 等[30]报道，通过对104例人肝组织样本中HCE1的表达水平及对奥司他韦酶活性检测研究，发现随着人年龄的增大其HCE1的表达水平不断提高，成人肝微粒体HCE1对奥司他韦的水解活性分别是儿童及婴儿组的4倍和10倍左右，表明HCE1的表达水平可以反映其酶活性，与Shi 等[25]的研究结论一致。

HCE1可以快速促进哌醋甲酯(Methylphenidate)在体内的代谢失活和清除过程，哌醋甲酯是治疗注意缺陷多动障碍(Attention deficit hyperactivity disorder，ADHD)的一线药物[31]。HCE1对于哌醋甲酯的2种同型异构体(d-哌醋甲酯和I-哌醋甲酯)的代谢作用有立体选择性，它是哌醋甲酯在肝内发生首过立体选择性清除的一种关键性羧酸酯酶，无药理活性的I-哌醋甲酯的清除速度较有药理活性的d-哌醋甲酯的快[32]。若血浆中的HCE1酶活性缺失，即HCE1不能有效将哌醋甲酯水解为萘基酯，将会导致血浆中的哌醋甲酯浓度显著升高，则很容易诱发药物毒性。Zhu 等[14]在哌醋甲酯代谢能力明显缺陷人群的研究中识别了2个有功能的基因突变体——p.Gly143Glu 和p.Asp260fs。此后的许多研究均证实，携带 p.Gly143Glu 和p.Asp260fs 其中的一种或两种基因突变的个体其HCE1酶活性显著降低，对哌醋甲酯的药物代谢动力学有明显的改变。Nemoda 等[31]通过对122例匈牙利注意缺陷多动障碍患者人群ces1基因Gly143Glu 多态性与哌醋甲酯代谢间的关系研究发现，Gly143Glu 遗传多态性与哌醋甲酯的临床疗效没有显著的关联，但有5例携带Glu 等位基因的患者仅以小剂量哌醋甲酯就能有效消除注意缺陷多动障碍症状。

奥昔布宁(Oxybutynin)是一种具有较强的平滑肌解痉作用和抗胆碱能作用的解痉药物[33]，可有效降低膀胱内的压力，主要用于无抑制性和返流性神经源性膀胱功能障碍患者与排尿有关的症状缓解，如尿急、尿频、尿失禁、夜尿和遗尿等。奥昔布宁化学结构中含有酯键，因此HCE1也可以有效促进奥昔布宁的水解代谢。奥昔布宁在肝微粒体中的水解代谢活性主要取决于HCE1，且其药物的水解速率与HCE1的含量呈正相关。Sato 等[33]关于人肝微粒体和肝细胞液的药物动力学研究发现，真核重组表达的人肝微粒体羧酸酯酶中，HCE1对于奥昔布宁的药物水解代谢速率明显大于HCE2。Wong 等[34]报道，舒林酸(Sulindac)、布洛芬(Ibuprofen)、萘普生(Naproxen)、吲哚美辛(Indomethacin)等非甾体类抗炎药物因含有较大的酰基基团，培养的人胚肾293细胞内的HCE1能介导此类药物的水解代谢失活过程，且HCE1有很高的酶动力学活性，可导致此类药物的肿瘤细胞杀伤活性消失。若将舒林酸等非甾体类抗炎药物运用于肿瘤的临床治疗，应联合使用HCE1的抑制药物以达到抑制HCE1酶活性，从而达到充分发挥舒林酸等非甾体类抗炎药物的治疗效果。动物实验[34]也表明，双(对硝基苯基)磷酸酯(Bis-p-nitrophenyl phosphate,BNPP)与舒林酸的联合使用比舒林酸的单独使用，对裸鼠人胃腺癌移植瘤的肿瘤生长抑制效果更加明显，这可将药物的肿瘤抑制率从28%提高到57%(P=0.037)。

3 HCE1的毒物代谢功能

有机磷酸酯的急性中毒可以通过血清胆碱酯酶的含量进行检测，而慢性中毒可以通过红细胞乙酰胆碱酯酶的含量进行检测。单核细胞HCE1的含量很容易受到有机磷酸酯暴露水平的影响，有机磷酸酯可以完全抑制HCE1的酶活性，因此HCE1可以作为一个有效衡量有机磷酸酯暴露水平的一个指标[19]。早前有研究发现，马拉硫磷(Malathion,4049)中毒患者在其血清胆碱酯酶水平恢复正常及中毒症状缓解之前，其外周血单核细胞中 HCE1的染色可被完全抑制[19]。Hemmert 等[35]通过建立 HCE1与环沙林(Cyclosarin)相互作用的分子模拟结构发现，HCE1还可以立体选择性结合到神经毒素环沙林，同时还能自发性地水解神经毒素沙林(Sarin)。目前HCE1被作为一种气体神经毒素的药物靶点进行研究，也许HCE1酶活化中心的某一氨基酸突变，可以使之成为有机磷酸酯的有效水解酶类。酶活化位点的单个氨基酸突变对于有机磷酸酯的解毒和代谢是一个很好的治疗或预后的药物作用靶点，外周血单核细胞的HCE1含量及酶活性对于其环境代谢底物的疗效及毒性评价来说是一个良好的指标。

4 HCE1的脂质代谢功能

HCE1在肝脏及其他外周器官中胆固醇和脂肪酸的代谢和运输的过程中发挥重要作用[8-9]。甘油三酯脂酶主要包括激素敏感性脂肪酶(Hormone-sensitive lipase,LIPE)、脂肪甘油三酯脂酶(Adipose triglyceride lipase,PNPLA2)和HCE1，脂肪细胞的酯解作用主要是通过甘油三酯脂酶家族成员介导的，其中HCE1亦被称为胆固醇脂水解酶(Cholesterol ester hydrolase,CEH)，其含有胆固醇脂水解酶活性，可以有效水解巨噬细胞中的胆固醇酯[36-37]。细胞质中脂质小滴胆固醇酯的水解代谢是巨噬细胞胆固醇逆向转运(Macrophage reverse cholesterol transport,mRCT)过程的重要步骤。Zhao 等[38]以单核细胞/巨噬细胞系研究HCE1的过表达时发现，HCE1的高表达水平可以增强巨噬细胞内胆固醇逆向转运过程，可增加细胞内胆固醇的流出量，同时也可减少细胞内胆固醇酯的积聚，因此该酶在泡沫细胞及动脉粥样硬化形成过程中可能发挥着重要的作用[37,39]。此外，以二苯甲酰(Benzil，HCE1的特别抑制剂)处理负载有胆固醇的THP1巨噬细胞的研究也发现，在有利于胆固醇酯流出细胞的情况下，细胞内仍有大量胆固醇滞留[40]。另外，HCE1可识别甘油三酯、棕榈酰CoA、长短链酰基甘油、中长链酰基肉毒碱、长链酰基CoA 酯等内源性底物[41-42]。HCE1含有脂肪酰基CoA 水解酶、酰基CoA：胆固醇酰基转移酶活性[43]，可参与胆固醇的代谢过程，如胆固醇酯的水解、脂肪酰基CoA 的水解、酰基CoA：胆固醇酰基的转移、酰基肉毒碱的水解，脂肪酰：乙酯的合成等反应[44]。

HCE1在体内脂肪酸的代谢过程中也发挥着不可忽略的作用。Steinberg 等[45]报道，肥胖个体的皮下脂肪组织和内脏脂肪组织中ces1基因的mRNA 表达水平显著高于瘦弱个体。Jernås 等[46]也发现，肥胖个体HCE1表达水平明显高于瘦弱个体，皮下脂肪组织中HCE1含量显著高于内脏脂肪组织，而随着人体重的减轻，其HCE1表达水平逐渐降低。脂肪组织中HCE1表达水平可以反应体脂和脂肪的含量，并与总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等代谢指标有关，表明脂肪组织内HCE1表达水平的提高与肥胖及体内脂质代谢功能紊乱密切相关。Marrades 等[8]也证实，肥胖患者腹部皮下脂肪组织样本中HCE1的表达水平上调，且与腰围、腰围/高度比、血浆葡萄糖水平、甘油三酯水平、心血管危险因素——总胆固醇/高密度脂蛋白胆固醇比值呈正相关。Nagashima 等[9]通过34例腹部外科手术患者的皮下、网膜、肠系膜脂肪组织样本研究，发现皮下脂肪、肠系膜脂肪的ces1基因mRNA 表达水平与细胞溶质中的甘油三酯脂酶活性以及肥胖呈正相关。以上研究均表明，HCE1可能参与人体脂肪组织中的脂质代谢过程，其基因突变及表达失调可导致脂质代谢紊乱，与肥胖的胰岛素抵抗和心血管疾病诱发因素存在密切的关联，可诱发肥胖相关疾病(如高胆固醇血症)的发生和发展。

5 HCE1早期诊断肝细胞肝癌

首次研究HCE1在正常肝脏组织和肝癌组织的表达差异是在2002年，Lim 等[47]通过双向聚丙酰凝胶电泳(Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE)和基质辅助激光解吸/电离时间飞行质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI–TOF MS)法分析6例肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)患者组织样本中的蛋白表达差异水平发现，肝癌组织样本中HCE1的表达水平显著低于正常肝组织及肝硬化组织，因此Lim 等[47]大胆提出HCE1可作为肝细胞肝癌检测的一个肿瘤标志物。接着，Liu等[48]利用抑制消减杂交法(Suppression subtractive hybridization,SSH)及cDNA 微阵列方法也证实肝细胞肝癌患者的肝癌组织中HCE1含量较低。Na 等[10]报道，通过对58例肝细胞肝癌患者的肝组织样本研究也发现，与正常肝组织相比，肝癌组织中HCE1表达水平显著下调，表明肝癌细胞的生长可能会抑制HCE1的表达水平，但具体机制仍不清楚。因此，Na 等[10]通过采用磁珠法免疫共沉淀(Magnetic bead-based immunoprecipitation)及纳升级液相色谱串联质谱(Nano-LC-MS/MS)方法分析了从肝细胞肝癌患者肝组织分泌到血浆的N-连接糖蛋白，首次发现HCE1在肝细胞肝癌患者血浆中的含量较高，并显著高于健康志愿者、肝硬化、慢性肝炎、胆管上皮癌、胃癌及胰腺癌患者血浆中HCE1的含量，且该指标作为肝细胞肝癌标志物的灵敏度及特异度分别为70.0%及85.0%。Paik 等[11]在2012年申请的美国专利(Patent No:US 8198038)中也证实肝细胞肝癌患者血浆中HCE1的含量是健康志愿者的2～5倍，表明HCE1可作为早期诊断肝细胞肝癌的一个良好的血浆糖蛋白标志物。一般来说，N-连接糖蛋白可从内质网或高尔基体释放到血浆中，因此可导致细胞内蛋白水平下降。在肝细胞肝癌发展的过程中，血浆中HCE1分泌增多可能是肝内HCE1蛋白的N-连接糖基化激活反应所引起的，可导致肝内组织及细胞内HCE1含量下降。

6 总结与展望

HCE1主要分布在肝脏组织，是一个很重要的肝脏药物代谢水解酶，能有效催化羧酸酯类、氨甲酸酯类、酰胺类、硫酯类等药物、前体药物及环境毒物的水解和代谢，是评价代谢底物的临床疗效和药物毒性的一个良好的血清指标，有望成为有机磷酸酯毒物治疗或预后的药物作用靶点。HCE1在人体内脂质代谢方面也发挥着重要作用，参与胆固醇酯的水解和逆向转运过程，其基因突变及表达失调可导致脂质代谢紊乱，与肥胖、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化等心血管疾病诱发因素存在密切的关联。由于肝细胞肝癌患者血浆中HCE1表达显著升高，HCE1有望成为早期诊断肝细胞肝癌的一个良好的肿瘤标志物。

HCE1作为一种极具应用前景的羧酸酯酶，在药物代谢、毒物代谢、脂质代谢、肝癌诊断等方面有着十分重要的意义，但目前仍存在许多亟待解决的问题，如人ces1基因突变与药物临床疗效的关系，HCE1表达失调诱发脂质代谢紊乱的具体机制，HCE1与肝细胞肝癌的发生发展的关系等，需要在以后的研究中进一步阐明。鉴于早期诊断肝细胞肝癌的特殊功能，需要选用更灵敏和特异的检测方法，来定量测定人体血浆中HCE1的含量，从而为肝细胞肝癌的临床早期辅助诊断和治疗预后提供指导依据。

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