DNA条形码技术在大型海藻学研究中的应用及前景

丁兰平, 马元元, 黄冰心

(汕头大学, 广东汕头 515063)

DNA条形码(DNA barcoding)是一段特殊的、可用于物种鉴定的DNA序列, 是近几年以来国际上生物分类学研究的主要热点之一[1], 其技术的发展为后现代生物分类学的研究与完善提供了有力的手段。在一定前提条件下, 它既可以用来验证已知分类群鉴定的准确性, 也可以用来发现新的物种。

简单地说, DNA条形码是通过对一组来自不同生物个体的较短同源DNA序列进行 PCR扩增和测序, 并对序列进行多重比对和聚类分析, 从而将该个体精确定位到一个已描述的分类群中, 甚至还可提供充分的信息将某些物种定位到特定的地理种群[2]。

迄今为止, 已有大量的基因片段被作为DNA条形码用于物种的鉴定[3], 既有单一序列也有组合序列[3-5], 但对于植物 DNA条形码的选择还没有一个明确的统一标准。目前, 一般认为较理想的DNA条形码标准要具有如下特征: 1)种间具有明显的变异而种内变异足够小; 2)应尽可能是相同的一段DNA片段; 3)DNA片段应足够短, 长度约700 bp左右, 便于单向测序; 4)存在高度保守区域, 便于设计通用引物;5)目标DNA条形码应包含充分的进化信息, 便于对物种进行系统地位确认[6-7]。

用 DNA条形码对物种进行鉴定具有很多优点,1)不受个体形态特征变异和发育阶段影响; 2)对形态分类难以区分的类群, DNA条形码可从基因水平上提供一种分类鉴定依据; 3)核苷酸序列数据库作为数字化平台, 能弥补形态鉴定的不足, 从而有利于加快已知物种的识别速度。

鉴于近几年以来DNA条形码技术已在海藻学研究中得到了一定程度的应用和发展[8-19], 为了跟踪国际上的这种新变化, 本文尝试论述大型海藻学研究中DNA条形码技术的应用及前景, 目的是希望将其更广泛地应用于海藻物种多样性鉴定、新物种的发现等研究领域, 促使我国海藻分类学尽快融入国际后现代分类学系统中。

1 背景及发展史

人类在利用地球自然生物资源过程中逐步发展了生物分类学, 正确区分物种, 特别是具有重要经济和/或环境价值的种类, 都离不开对物种的分类鉴定。分类学的主要任务包括描述和鉴定物种, 提供简洁、方便的信息检索系统。分子系统学则是借助于分子水平的标记, 如基因序列进行的系统研究。分子水平标记是近十几年来广泛采用的指标, 但不同的指标针对的系统水平是不同的, 属间分类标准一般采用细胞核或质体基因组标记[20]。各种分子遗传标记的研究在陆地生物学中已深入开展, 在海洋生物学中分子遗传标记的研究也是方兴未艾[21]。注意到在物种鉴定中分子系统学的重要性, 最近数十年,利用DNA中携带的遗传信息来探讨植物的系统发育引起了广泛关注, 有许多是关于海藻的[3-4,8,11,22-23]。随着该领域研究的不断发展, 2003年, 加拿大 Paul Hebert教授等首次正式提出了 DNA条形码的概念[24]。其基本思想是通过DNA片段中A、T、C和G等 4个碱基在基因中的排列顺序识别物种, 原理类似于现代商品零售业的条形编码系统。2004年 5月, 在华盛顿成立了生物条形码联盟(consortium for the barcode of life, CBOL), 致力于发展鉴定生物物种的全球标准。

2 大型海藻及DNA条形码技术的应用

2.1 大型海藻

大型海藻一般指红藻、褐藻、绿藻和蓝藻等四大门类, 和海洋浮游藻类一起构成海洋的主要初级生产者。我国大型海藻物种资源比较丰富, 先后报道了1 277个物种[25]。长期以来, 由于简单的外部形态和内部生理结构、生理上的趋同性以及高度的表型可塑性, 海洋藻类成为用传统方法难以区分和鉴定的类群。海洋藻类的分类学一直是困扰人们的难题[26],随着 DNA条形码的出现, 近几年, 该技术已被逐渐应用于各种海洋大型藻类的分类和鉴定[11-12]。

2.2 DNA条形码技术的应用

随着浒苔的暴发, 我国海藻分类学研究成了颇具争议的焦点。面对严峻的质疑和挑战, 开拓新的分类学方法势在必行。其中, DNA条形码技术由于具有某些较明显的优势而吸引了大家的关注, 虽然在海洋藻类方面尚无统一的基因片断和研究标准。

2.2.1 不同基因序列在大型海藻方面的应用

相对于动物DNA条形码技术而言, 高等植物和藻类DNA条形码研究进展缓慢且存在较大争议。目前, 已知陆续有10种基因序列、15对引物应用到总计3个门类197个属403个物种中, 而且大多集中在红藻门, 达到 58%, 而绿藻门仅占 5.8%; 研究的基因主要是 COI(Mitochondrialcytochrome c oxidase subunit I, 细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ)基因(26.3%)、ITS(internal transcribed spacer, 内转录间隔区)(17.1%)、UPA(universal plastid amplicon, the portion of 23S rDNA)(12.9%)等[27]。然而一些作者选择的基因序列及研究对象各不相同, 无法判断目标引物的通用性及适用性。

Lin等[28]利用rbcL(1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶大亚基)基因片段扩增了仙菜目红叶藻科 48个属91份样品, 建立了红叶藻亚科、亮叶藻亚科和红肋藻亚科等三亚科系统进化树, 然而在更高分类阶元上如科、目等,rbcL基因就起不到应有的效果。Saunders等[8]分析了红藻 3个群体的 46个样品的COI, 发现它能准确地区分形态相似的种类, 并发现了一些新物种。Robba等[9]分析了红藻门 6个目 79份样品, 发现其种内差异为 0%～2.6%, 属内种间差异为5.2%～27.5%, 因此认为COI可以分辨近缘种,且可划分科级以下分类阶元。Sherwood等[29]分析了107份藻类样品, 包括红藻、绿藻、褐藻、蓝藻等, 发现 UPA片段变异范围非常大, 可将大多数种类区分开。褐藻分子系统学研究主要集中在 rRNA基因、rbcL和rbcS序列分析上[26], Lane等[30]利用COI、ITS和rbcSp (Plastid Rubisco operon spacer)基因分析了褐藻门翅藻属Alaria的54个样品, 发现单一的COI基因片段效果不佳, 而 3个基因片段的组合则能有效区分大部分种类。Brodie等[31]分析了红藻门紫菜属 102份样品, 发现 COI基因片段能将样品鉴定到种。Yang等[32]分析了红藻门江蓠属11个种的28份样品, 发现 COI基因片段在江蓠属内的种间差异为13%±3.2%, 种内差异为0.9%, 可将样品区分为7个地理群; 而rbcL基因片段在江蓠属内的种间差异为1.2%～12.6%(平均 9.7%), 种内差异为 0.289%。Conklin等[33]分析了红藻门麒麟菜属和卡帕藻属的15个样品, 发现这两个属的UPA基因片段有明显差异, 而属内差异则非常小, 而 COI基因片段在属级水平上则有明显的差异。Freshwater等[14]发现红藻门石花菜目的COI序列比rbcL序列更多变, 在姐妹种间具有更大的间隔区, 认为 COI基因更适合作为石花菜目的分子辅助鉴定标签。Rueness[34]对海洋红藻中两种多管藻 COI序列进行了比较, 表明它们只有1.2%的不同, 这两种藻类的分类情况被解决。KIM等[35]分析了红藻门5个种类75个样本的COI序列,其中4种江蓠, 一种是龙须菜, 种内不符合的偏差范围在 0%～0.9%之间, 种间偏差是 9.2%～16.1%。Sherwood等[36]分析了红藻门的17个目290份样品,发现UPA标记序列成功率为64.7%, 而COI序列是46.8%, 表明这两个序列在鉴定该样品方面存在一定的差异性。Mattio等[37]研究潜在的 5种不同的标记作为DNA条形码应用在褐藻门马尾藻属, 结果论证了ITS-2和RubisCO作为条形码标记的不充分性, 虽然它们暗示了作为线粒体标记的潜在性, 还需要额外的研究去进一步评估这些标记的鉴定成功性。McDevit等[38]分析了褐藻门20个属106个种的COI基因片段, 发现其属内种间差异为 3.04%～10.08%,种内差异为0.00%～0.46%。Macaya等[13]分析了世界19个地点的巨藻属样品(褐藻门)的 COI基因, 发现分布于南半球的隔离种类均为单倍型的。Kucera[18]将COI-5P(the 5'region of the mitochondrial cytochrome oxidase 1)作为 DNA条形码应用到褐藻门墨角藻属Fucus的样品鉴定中, 发现它与其他标记有相同的作用。

目前在褐藻和红藻中 COI基因片段都是较为理想的条形码片段, 但是针对绿藻 COI基因片段研究较少。

Saunders和Kucera[11]评估了海洋绿藻的rbcL、tufA、UPA、LSU和ITS等片段作为DNA条形码标记的效果, 发现仅ITS有较低的成功率、tufA标记在扩增时有 95%的成功率(除刚毛藻科外), 认为 tufA适合作为海洋绿藻条形码的标准分子标记。腾林宏[39]对刚毛藻目不同样品序列的分析和构建的系统树清楚地表明, ITS和18S r DNA序列种间差异明显大于种内差异, 18S rD N A序列种内差异0.0%～0.1%, 种间差异在0.3%～6.1%; ITS序列种内差异0.0%～1.7%,种间差异 4.9%～63.4%, 显示出分子方法对刚毛藻目物种的分类鉴定具有重要辅助作用。因此, 她认为,根据国际DNA条形码的技术标准, 这两个序列可以作为其分子条形码对物种进行快速有效的鉴定[39]。

讫今, NCBI(美国国立生物技术信息中心)已公布了44种藻类叶绿体全基因组和40种藻类线粒体全基因组序列, 这是进一步设计和开发大型海藻DNA条形码的有用资源, 将在基因水平阐述各级分类阶元的划分与系统构建提供有力的支撑信息。

2.2.2 作为条形码的不同基因的优缺点

DNA条形码需要有一个通用的标准序列, 但是找到能够区分全部物种的理想DNA片段比较困难。目前认为, 线粒体基因适合作为通用DNA条形码序列, 因为它没有内含子, 很少有重组现象, 并且大多为母系遗传的单倍体。但植物线粒体基因组进化速率慢, 达不到条形码的通用性要求, 因此植物 DNA条形码序列主要在叶绿体和核基因上进行选择。生物条形码联盟植物工作组已经决定将叶绿体rbcL和matK(叶绿体基因组的成熟酶基因)两个基因片段作为植物 DNA标准条形码的核心条码, 叶绿体trnH-psbA(叶绿体非编码区片段)片段和核基因片段ITS为植物DNA条形码的补充条码。

(1)COI

2003年, Herbert研究发现利用COI基因一段长度为648bp的片断, 能够在DNA水平上成功地区分物种。COI基因序列是区分种间差异的有效分子标记, 因此可以利用 COI基因序列将因地理环境等因素造成表型各异的不同物种和其他种区分开来[40]。

COI基因具有以下优点: 1) COI基因比核基因具有更丰富的系统进化信息, 和目前已知的其他蛋白质基因相比, COI密码子第3个位点的碱基置换更频繁, 进化速率比12S r DNA和16S rDNA快3倍[41];2) COI序列比较短, 在650 bp中就有4650个ATGC的可能组合, 一般情况下其序列种间遗传变异大于种内遗传变异[42]。缺点: 1)COI基因在植物中的进化速率远慢于在动物中的, 只适用于低等植物中某些藻类的鉴定[43-44]; 2)对通常选择COI作为DNA条形码的标记基因的, 因 COI不能含盖全部物种, 所以有时需要选择使用其他片段作为辅助标记基因。已有研究者研究证实COI基因作为DNA条形码能够准确地区分红藻门物种[8-9]。

(2)nrITS

核基因组的核糖体DNA ITS片段广泛分布于光合真核生物(蔗类植物除外)中, 是系统学研究中最常用的片段之一。从Baldwin[45]首次把ITS应用于植物系统发育研究以来, ITS已经成为系统发育重建中最受欢迎的序列之一。

ITS的具有如下优点: 1)在核基因组中是高度重复的, 有利于扩增、克隆和测序[46]; (2)经过协同进化,不同 ITS拷贝间的序列接近纯合[47], 可对种间关系进行精确重建。因此Kress等最早将其视为植物条形码候选片段。组成该片段的不同部分(ITS1、ITS2和5.8S)序列变异差别较大, 5.8S最为保守, ITS1的识别效果好于ITS2[48]。ITS2片段较短, 易于扩增和测序,尤其对发生DNA降解的材料更为有利[49-50], 该片段在种间水平上变异较大, 已被广泛用于物种分子鉴定、系统进化和植物条形码研究[6]。

其缺点: 1)扩增成功率是ITS作为条形码应用的一个限制因素。Kress和Erickson[51]报道, ITS1正确识别率为 81.5%, 但其扩增成功率仅为 60.4%, 因此全部样品的正确识别率则下降为45.8%。2)长度变异大, 多数物种扩增片段长度超过1 100 bp。3)存在长的 Poly-G、poly-C和 poly-A, 导致测序和序列分析困难[52]。4)核基因自身存在多拷贝的特性, 在某些类群中种内变异较大, 降低了它作为条形码的应用性[51]。已有研究者发现 ITS作为海藻的一些类群的DNA条形码标记时有较低的成功性[11,37]。

但是, 随着测序技术的发展及数据分析技术的进步, ITS作为组合的条形码之一, 仍具有很大的应用前景。有研究者用包括ITS在内的3个基因研究藻类, 发现用 3个基因片段的组合能够有效区分大部分种类[30]。

(3)matK

matK序列是植物叶绿体 DNA中进化较快的一条编码区序列, 也是多位研究者推荐的条形码序列之一[5]。matK基因位于叶绿体赖氨酸 tRNA基因(trnK)的内含子中, 长约 1550bp, 编码一种参与RNA转录体中II型内含子剪切的成熟酶[53], 为单拷贝编码基因。

matK基因具有如下优点: 1)其进化速率大约是rbcL的2～3倍[54]; 2)该基因在系统学研究方面的应用十分普遍[55-58]。缺点: 1)一些学者发现在 DNA条形码研究中, mazK扩增效果并不理想[52,59]; 2)matK片段的引物通用性较差, 鉴定不同类群时往往需要设计不同的引物[60-61]。因此, 只有在解决了matK序列的扩增问题, 才有可能作为 DNA条形码使用。Sanders等在分析轮藻科6个属的藻类时, 发现matK基因能够鉴定的轮藻科平均分枝长度超过rbcL基因的5倍, 更适合轮藻科的分类鉴定[62]。目前,matK基因在大型海藻物种鉴定方面的应用研究报道较少。

(4)trnH-psbA

trnH-psbA片段是叶绿体基因中进化速率最快的片段之一[63]。其优点是1)其序列两端具有约75bp的保守区, 便于设计通用引物[64]; 2)trnH-psbA序列已经在很多植物中扩增成功, 且有很好的鉴别能力[59];3)92%的物种扩增片段长度为 340～660bp, 且均具有独特的间隔区序列, 符合理想的条形码标准[6]。其缺点是: 1)该片段中普遍存在插入/缺失事件, 即使在近缘种间也是如此[65], 导致不同物种间片段长度变异较大; 2)该片段具有较高的突变率和简单的序列重复和重排, 在进行序列分析时需要人工校正[60], 从而限制了在系统发育研究中的应用。由于插入/缺失过多, 导致trnH-psbA在不同属物种间的比对困难[6,66]。然而, 比对的难易不是条形码必需的条件,只要建立了适合的条形码数据分析方法, 插入/缺失还将会丰富物种识别信息[6]。由于trnH-psbA变异大,主要适用于被子植物中物种丰富的属。目前, 很少有研究报道trnH-psbA在大型海藻物种鉴定方面的应用。

(5)rbcL

rbcL基因为核酮糖-1, 5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)的大亚基, 长度约为1 400 bP, 无内含子。

rbcL具有如下优点: 1)在大部分植物中,rbcL片段都比较容易扩增和测序, 已有许多相关报道[67-69];2)目前,rbcL基因已广泛应用于被子植物科级以上较高类群之间的系统发育分析[70]; 3)rbcL序列具有通用、易扩增、易比对的特点, 被提议作为条形码片段,可以用作核心片段将某些未知样品识别到种级以上水平; 4)通过使用GenBank中大约10 300条长度大于1 000 bp的rbcL序列进行比较分析, Newmaster等发现尽管rbcL不能识别全部物种, 但可以区分不少同属植物。缺点: (1)由于Rubisco在光合作用及光呼吸中所起的关键作用,rbcL基因的进化明显受功能限制, 它的编码序列高度保守。2)植物中rbcL片段的变异主要存在于种级以上水平, 物种水平的变异通常不够[51-52,59,66]。因此, 有人建议将rbcL与其他DNA基因片段组合使用[71]。但存在的问题是,rbcL的整体长度较长(至少1 300 bp), 需要使用4个引物并进行双向测序才能完成整个基因的测序[6], 而理想的条形码要求片段长度较短, 因此有些研究仅选取其中一段进行扩增, 如rbcL-a[71]。Kucera 在 2010年对rbcL、UPA及ITS等片段进行了评估, 发现rbcL-3P在若干隐存种类(由于在长期的进化过程中其形态停滞, 从而使其根据形态特征被命名为同一种名的不同种)中作用很显著, 能够很好地区分石莼属的种类。还有一些研究者已证明了rbcL在鉴定一些大型海藻方面的效果[14,19]。

(6)UPA片段

UPA片段非常适合于藻类的研究, 同时也可作为陆地植物的组合条形码之一[3]。有研究者提议将UPA片段作为光合作用植物的DNA条形码, 已有研究表明 UPA片段在海藻中存在一定的变异, 但在陆地植物中变异率很低[52,72-73]。Kucera 在2010年利用COI-5P作为 DNA条形码对加拿大红藻门紫菜品种进行鉴定时, 通过与rbcL及UPA进行了比较, 从而发现了两个新种。姚雪等[27]发现 COI、UPA、rbcL三种基因片段引物具有较高的通用性, 在三个门类28种海藻的 38份样品中获得有效基因序列为65%～82%, 显示出这三个基因片段具有一定的通用性价值。有研究者分析了红藻门多个类群的样品, 发现其UPA基因片段能够较好的辨别物种[33,36]。

(7)多片段组合

如上所述, 在植物中, 采用单片段的识别率一般不高, 往往不能达到条形码的要求[52,59,71-72], 靠一个片段来区分杂交种或存在基因渗透的类群也存在问题[67]。因此, 很有必要把来源于不同基因组的片段加以组合。任保青等[74]认为: 在整个植物界, 若想用1个基因或1个短的DNA片段来区别所有物种几乎是不可能的, 但是可以通过 1个条形码组合在基因组范围内实现阶层条形码, 进而逐级缩小鉴定范围,最终达到物种自动鉴定的目的。多序列组合方案为植物DNA条形码的研究指出了一个新的方向, 但根据现有的研究结果筛选出的片段并不能完全满足DNA条形码的标准, 仍需要大量的实验去验证它们的物种识别和鉴定能力。目前, 多序列组合在大型海藻方面也有很广阔的应用前景[31]。

3 DNA条形码技术在海藻学的应用前景及存在的问题

众所周知, 大型海藻因其生长环境、发育阶段的不同, 外部形态经常发生很大的变化, 这就给主要依据形态特征来鉴别物种的经典分类工作带来很大困难。某些藻类的分类结果一直存在争议。与此同时尚存在大量未命名海藻种类, 已命名的物种也存在同物异名和异物同名现象。新兴的DNA条形码技术能够对我国大型海藻进行高效鉴定和分类, 进而加速新物种的发掘。目前, 利用DNA条形码技术对我国大型海藻进行物种鉴定和分类的报道还较少。随着DNA条形码的广泛应用, 整个技术体系日趋完善, 其在我国大型海藻分类鉴定方面将有广阔的应用前景。

需要强调的是, DNA条形码技术的使用不能完全脱离经典的分类学研究方法, 尤其是未知或尚未界定的物种的分类鉴定工作[75]。

DNA条形码技术在应用时仍然存在一些问题。在整个基因组中, 有大量的基因序列能够满足我们一个或多个要求。作为DNA条形码技术的标准基因,必须一方面足够保守(其引物有强的保守性, 能够进行大范围的物种扩 増 ), 另一方面有足够的变异来区分不同物种从而达到鉴定的目的, 但是理论上不存在一种普遍适用的DNA条形码基因。任何一个基因都不可能在各种生物中都保守, 同时又包含足够的序列变异信息来进行物种的辨别。因此, 在鉴定不同的物种时, 需要确定不同的目的基因。另外, 植物的线粒体DNA因杂交和基因渗入而变异很小, 真菌线粒体DNA含有内含子。对这些特殊类群的标准条形码基因的选择还有待进一步探讨。另外物种间杂交造成了在种的水平上有较大的差异, 不同物种同一片段的进化速率不同, 同时受制于取样数量以及地理群体代表性等, 都可能导致种间遗传差异的增大。这使得在藻类中建立类似于动物的 COI基因片段DNA条形码技术成为一项艰巨的任务。但是, 随着条形码序列数据的不断积累及其研究范围的不断扩大, 条形码技术将逐渐实现与世界范围内其他分类学研究计划的协调发展, 作为一种物种鉴定工具,势必在生物系统学和分类学研究中得到广泛应用。

[1]葛家文, 王好转. DNA条形码与生物分类学研究[J].畜牧与饲料科学, 2009, 30(5): 52-53.

[2]Gregory T R.DNA barcoding does not compete with taxonomy[J]. Nature, 2005, 434: 1067.

[3]刘宇婧, 刘越, 黄耀江, 等. 植物DNA条形码技术的发展及应用[J]. 植物资源与环境学报, 2011, 20(1):74-82, 93.

[4]宁淑萍, 颜海飞, 郝刚, 等. 植物DNA条形码研究进展[J]. 生物多样性, 2008, 16(5): 417-425.

[5]李妮, 陈士林, 刘义梅, 等. 葫芦科植物通用DNA条形码的筛选[J]. 中草药, 2011, 42(7): 1396-1401.

[6]Kress W J, Wurdack K J, Zimmer EA, et al. Use of DNA barcodes to identify flowering plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(23): 8369-8374.

[7]Taberlet P, Coissac E, Pompanon F, et al. Power and limitations of the chloroplast trnL(UAA)intron for plant DNA barcoding[J]. Nucleic Acids Research, 2007,35(3): 1-8.

[8]Saunders G W. Applying DNA barcoding to red macroalgae: a preliminary appraisal holds promise for future applications [J]. Phil Trans R, Soc B, 2005, 360:1879-1888.

[9]Robba L, Russell S J, Barker G L, et al. Assessing the use of the Mitochondrial cox1 marker for use in DNA barcoding of red Algae (Rhodophyta)[J]. American Journal of Botany, 2006, 93(8): 1101-1108.

[10]Evans K M, Mann D G. A proposed protocol for nomenclaturally effective DNA barcoding of microalgae[J]. Phycologia, 2009, 48(1): 70-74.

[11]Saunders G W, Kucera H. An evaluation ofrbcL, tufA,UPA, LSU and ITS as DNA barcode markers for the marine green macroalgae[J]. Cryptogamie Algologie,2010, 31(4): 487-528.

[12]Mcdevit D C, Saunders G W. A DNA barcode examination of the Laminariaceae (Phaeophyceae)in Canada reveals novel biogeographical and evolutionary insights[J].Phycologia, 2010, 49: 235-248.

[13]Macaya E C, Zuccarello G C. DNA barcoding and genetic divergence in the giant kelp macrocystis (Laminariales)[J]. Journal of Phycology, 2010, 46(4):736-742.

[14]Freshwater D W, Tudor K, O’Shaughnessy K, et al.DNA barcoding in the red algal order Gelidiales: comparison of COI withrbcLand verification of the “barcoding gap”[J]. Cryptogamie Algologie, 2010, 31(4):435-449.

[15]Gile G H, Stern R F, James E R, et al. DNA barcoding of Chlorarachniophytes using nucleomorph its sequences[J]. Journal of Phycology, 2010, 46: 743-750.

[16]Saunders G W, McDonald B. DNA barcoding reveals multiple overlooked Australian species of the red algal order Rhodymeniales (Florideophyceae), with resurrection ofHalopeltisJ. Agardh and description ofPseudohalopeltisgen. Nov.[J]. Botany, 2010, 88: 639–667.

[17]Legall L, Saunders G W. Establishment of a DNA-barcode library for the Nemaliales (Rhodophyta)from Canada and France uncovers overlooked diversity in the speciesNemalionhelminthoides(Velley)Batters[J]. Cryptogamie Algologie, 2010, 31(4): 403-421.

[18]Kucera H. Species identification and discovery in common marine macroalgae:Fucus, PorphyraandUlvausing a DNA barcoding approach[D].The University of New Brunswick, PHD, 2010.

[19]Manghisi A, Morabito M, Bertuccio C, et al. Is routine DNA barcoding an efficient tool to reveal introductions of alien macroalgae? A case study ofAgardhiella subulata(Solieriaceae, Rhodophyta)in Cape Peloro lagoon (Sicily, Italy)[J]. Cryptogamie Algologie, 2010,31(4): 423-433.

[20]隋正红, 张学成, 孙雪. 红藻分子生物学研究进展 II分子系统学与进化[J]. 海洋科学, 2004, 28(6): 5-59.

[21]刘志毅, 相建海. 微卫星 DNA分子标记在海洋动物遗传分析中的应用[J]. 海洋科学, 2001, 25(6): 11-13.

[22]高杨, 梁君荣, 高亚辉, 等. 赤潮拟菱形藻形态学分类和分子生物技术鉴定研究概述[J]. 海洋科学, 2005,29(1): 67-72.

[23]汪文俊, 许璞, 王广策, 等. 红毛菜生物学研究进展II. 系统分类学研究[J]. 海洋科学, 2008, 32(5):73-77.

[24]Hebert P D N, Cywinska A, Ball S L, et al. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proc Biol Sci,2003, 270: 313-321.

[25]丁兰平, 黄冰心, 谢艳齐. 中国大型海藻的研究现状及其存在的问题[J]. 生物多样性, 2011, 19(6):798-804.

[26]徐涤, 秦松. 海洋褐藻分子系统学研究进展[J]. 海洋科学, 2002, 26(2): 19-22.

[27]姚雪, 于丹, 王绪敏, 等. 大型海洋藻类DNA条形码技术的开发与应用[J]. 应用技术, 161-162.

[28]Lin S M, Fredericq S, Hommersand M H. Systematics of the Delesseriaceae (Ceramiales, Rhodophyta)based on LSU rDNA andrbcLsequences, including the Phycodryoideae, subfam Nov[J]. Journal of Phycology,2001, 37: 881-899.

[29]Sherwood A R, Presting G G. Universal primers amplify a 23S rDNA plastid marker in eukaryotic algae and cyanobacteria[J]. Journal of phycology, 2007, 43:605-608.

[30]Lane C E, Lindstrom S C, Saunders G W. A molecular assessment of northeast PacificAlariaspecies (Laminariales, Phaeophyceae)with reference to the utility of DNA barcoding [J]. Mol Phylogen Evol, 2007, 44:634-648.

[31]Brodie J, Mortensen A, Ramirez M E, et al. Making the links: towards a global taxonomy for the red algal genusPorphyra(Bangiales, Rhodophyta)[J]. J Appl Phycol, 2008, 20: 939-949.

[32]Yang E C, Kim M S, Geraldino P J L, et al.Mitochondrial cox1 and plastidrbcLgenes ofGracilariavermiculophylla(Gracilariaceae, Rhodophyta)[J]. Journal of applied phycology, 2008, 20:161-168.

[33]Conklin K Y, Kurihara A, Sherwood A R. A molecular method for identification of the morphologically plastic invasive algal generaEucheumaandKappaphycus(Rhodophyta, Gigartinales)in Hawaii[J]. J Appl Phycol,2009, 21: 691-699.

[34]Rueness J. DNA barcoding of select freshwater and marine red algae (Rhodophyta)[J]. Cryptogamie, Algologie, 2010, 31(4): 377-386.

[35]Kim M S, Yang M Y, Cho G Y.Applying DNA barcoding to Korean Gracilariaceae (Rhodophyta)[J]. Cryptogamie, Algologie, 2010, 31(4): 387-401.

[36]Sherwood A R, Sauvage T, Kurihara A, et. al. A comparative analysis of COI, LSU and UPA marker data for theHawaiian florideophyteRhodophyta: implications for DNA barcoding of red algae[J].Cryptogamie, Algologie, 2010, 31(4): 451-465.

[37]Mattio L, Payri C. Assessment of five markers as potential barcodes for identifyingSargassumsubgenusSargassumspecies (Phaeophyceae, Fucales)[J]. Cryptogamie, Algologie, 2010, 31(4): 467-485.

[38]Mcdevit D C, Saunders G W. On the utility of DNA barcoding for species differentiation among brown macroalgae (Phaeophyceae)including a novel extraction protocol[J]. Phycological research, 2009, 57:131-141.

[39]滕林宏. 中国刚毛藻目海藻的形态及系统发育学研究——兼 DNA 条形码技术在刚毛藻目的应用初探[D]. 北京: 中国科学院研究生院, 2011.

[40]张姝, 李喜莲, 崔朝霞, 等. 线粒体基因片段在梭子蟹系统发育及物种鉴定中的应用[J]. 海洋科学, 2008,32(4): 9-18.

[41]Knowlton N, Weigt L A. New dates and new rates for divergence cross the Isthmus of Panama [J]. Proc R Soc Lond B, 1998, 265: 2257-2263.

[42]Dayrat B. Towards integrative taxonomy [J]. Biol J Linn Soc, 2005, 85: 407-415.

[43]Blaxter M, Mann J, Chapman T, et al. Defining operational taxonomic units using DNA barcode data[J].Philos Trans R Soc B: Biological Sciences, 2005, 360:1935-1943.

[44]Rach J, DeSalle R, Sarkar I N, et al. Character-based DNA barcoding allows discrimination of genera, species and populations in Odonata [J]. Proc R Soc B:Biological Sciences, 2008, 275: 237-247.

[45]Baldwin B G. Molecular phylogenetics ofCalycadenia(Compositae)based on ITS sequences of nuclear ribosomal DNA: Chromosomal and morphological evolution reexamined[J]. Amer J Bot, 1993, 80: 222-238.

[46]石开明, 彭昌操, 彭振坤, 等. DNA序列在植物系统进化研究中的应用[J]. 西北民族学院学报, 2002,20(4): 5-10.

[47]李学营, 彭建营, 白瑞霞. 基于核 rDNA的 ITS序列在种子植物系统发育研究中的应用[J]. 西北植物学报, 2005, 25(4): 829-834.

[48]Chase M W, Salamin N, Wilkinson M, et al. Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term goals[J]. Philos Trans R Soc Lond B: Biol Sci, 2005,360: 1889-1895.

[49]罗焜. 基于芸香科、天南星科的植物DNA条形码通用序列研究[D]. 武汉: 湖北中医药大学, 2010.

[50]Chiou S J, Yen J H, Fang C L, et al. Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers[J]. Planta Medica, 2007, 73(13): 1421-1426.

[51]Kress W J, Erickson D L. A two-locus global DNA barcode for land plants: the codingrbcLgene complements the non-codingtrnH-psbAspacer region[J]. PloS One, 2007, 2: e508.

[52]Sass C, Little D P, Stevenson D W, et al. DNA barcoding in the Cycadales: testing the potential of proposed barcoding markers for species if identification of cycads[J]. PloS One, 2007, 2: ell54.

[53]Neuhaus H, Link G. The chloroplast tRNALys(UUU)gene from mustard (Sinapsis alba)contains a class H intron potentially coding for a maturase related polypeptide[J]. Curr Genet, 1987, 11: 251-257.

[54]Gadek P A, Alpers D L, Heslewood M M, et al. Relationships within Cupressacea sensu lato: a combined morphological and molecular approach[J]. American Journal of Botany, 2000, 87: 1044-1057.

[55]Khidir W, Hilu, Lawrence A. Alice. Evolutionary implications ofmatKindels in Poaceae[J]. American Jornal of Botany, 1999, 86: 1735-1741.

[56]金虹, 施苏华, 潘恒犯, 等. 含笑亚族及其近缘植物matK基因序列分析[J]. 中山大学学报, 1999, 38(l):94-98.

[57]Mark E, Mort, Douglas E, et al. Phylogenetic relationships and evolution of Crassulaceae inferred frommatKsequence data[J]. American Journal of Botany, 2001, 88:76-91.

[58]李保进. 叶籽银杏matK和JTS序列分析及系统发育研究[D]. 山东: 山东农业大学, 2008.

[59]Newmaster S G, Fazekas A J, Steeves R A D. Testing candidate plant barcode regions in the Myristicaceae[J].Molecular Ecology Resources. 2008, 8(3): 480-490.

[60]Hollingsworth P M, Forrest L L, Spouge J L, et al. A DNA barcode for land plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106(31): 12794-12797.

[61]Chase M W, Cowan R S, Hollingsworth P M, et al. A proposal for a standardised protocol to barcode all land plants[J]. Taxon, 2007, 56: 295-299.

[62]Sanders E R, Karol K G, McCourt R, et al. Occurrence ofmatKin a trnK group II intron in charophyte green algae and phylogeny of the Characeae[J]. American Journal of Botany, 2003, 90(4): 628-633.

[63]torchová H, Olson M S. The architecture of the chloroplastpsbA-trnHnon-coding region in angiosperms[J].Plant Systematics and Evolution, 2007, 268: 235-256.

[64]Shaw J, Edgar B, Lickey, et al. The tortoise and the hare. II. Relative utility of 21 noncoding chloroplast DNA sequences for phylogenetic analysis[J]. American Journal of Botany, 2005, 92: 142-166.

[65]Aldrich J B W, Chemey E, Merlin L C. The role of insertions/deletions in the evolution of the intergenic region betweenPsbAandtrnHin the chloroplast genome[J]. Curr Genet, 1988, 14: 137-146.

[66]Lahaye R, van der Bank M, Bogarin D, et al. DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 2008b, 105: 2923-928.

[67]Newmaster S G, Fazekas A J, Ragupathy S. DNA barcoding in the land plants: evaluation ofrbcLin a multigene tiered approach[J]. Canadian Journal of Botany,2006, 84: 335-341.

[68]李耀利, 朱华, 杨俊波. 从rbcL序列探讨单室茱萸属的系统位置[J]. 云南植物研究, 2002, 24(3): 352-358.

[69]王彦涵, 张寿州, 高建平, 等. 从叶绿体 DNArbcL序列分析探讨五味子科的系统发育[J]. 复旦学报:自然科学版, 2003, 42(4): 550-554.

[70]胡雅琴, 肖娅萍.rbcL、matK基因在植物系统进化分析中的应用[J]. 中学生物教学, 2002, 12: 1-3.

[71]Kress W J, Erickson D L. A two-locus global DNA barcode for land plants: the codingrbcLgene complements the non-codingtrnH-psbAspacer region[J].PLoS One, 2007, 2(6): e508.

[72]Fazekas A J, Burgess K S, Kesanakurti P R, et al. Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well[J]. PLoS One,2008, 3(7): e2802.

[73]Presting G G. Identification of conserved regions in the plastid genome: implications for DNA barcoding and biological function[J]. Canadian Journal of Botany,2006, 84: 1434-1443.

[74]任保青, 陈之端. 植物 DNA 条形码技术[J]. 植物学报, 2010, 45(1): 1-12.

[75]Desalle R. Species discovery versus species identification in DNA barcoding efforts: response to Rubinoff[J].Conserv Biol, 2006, 20(5): 1545-1547.