草甘膦对大豆根尖细胞损伤的彗星试验初探
2012-02-05李广领刘英杰管文芳陈锡岭
李广领,刘英杰,管文芳,陈锡岭
(河南科技学院,河南新乡453003)
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis,SCGE)又称慧星试验(comet assay),该技术最初是由Ostling和Johansos于1984年在Cook、Rydberg和Johanson方法基础上进行改进而建立的中性慧星试验技术[1],Singh于1988年又在此基础上又对该试验方法进行改进,开发出了碱性条件下的SCGE技术,进一步提高了DNA损伤检出的灵敏度[2].该技术可以定量检测真核细胞中的单链断裂、双链断裂、碱性不稳定位点、不完全切除修复位点和DNA交联等多种DNA伤害情况[3].在以前的研究中,彗星试验多是利用动物细胞DNA的损伤来检测环境污染物的致突变性和基因毒性,1996年Koppen第一次报道了利用植物为试验材料进行彗星试验[4],此后不断有人利用植物彗星试验进行深入研究,使该技术扩展至环境监测[5-7]和生态评估[8-10]等领域.草甘膦(glyphosate)作为有划时代意义的广谱性和灭生性除草剂,目前已成为世界上应用最广、产量最大的农药品种[11].近年来,随着转基因抗草甘膦作物的发展,草甘膦用量还在逐年增加.本研究以转基因抗草甘膦大豆育种材料为试验材料,利用SCGE技术检测草甘膦对其遗传物质的损伤情况,旨在为抗草甘膦转基因大豆品种选育提供技术支持.
1 材料与方法
1.1 试验仪器
10 mL玻璃匀浆器(海门市华凯实验玻璃仪器有限公司),DYY-10型电泳仪(北京市六一仪器厂),JY-SPFT潜水式电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司),HH-2数显恒温水浴(金坛市汉康电子有限公司),BCD-195KAN冰箱(青岛海尔股份有限公司),MP120-2型电子分析天平(上海奕宇仪器仪表有限公司),BS-1EA数显培养箱(金坛市杰瑞尔电器有限公司),NikonE600荧光显微镜及数码成像系统(日本尼康公司),彗星图像分析软件为CASP软件(casp1.2.2)等.
1.2 试剂与材料
1.2.1 试剂和药品果胶酶和纤维素酶(上海研拓生物科技有限公司);正常熔点琼脂糖(NMA)和低熔点琼脂糖(LMA)(上海佳和生物科技有限公司产品);十二烷基肌氨酸钠和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(Sigma产品);Tricine、Tris-HCl和Triton-X-100(Solarbio产品);溴化乙锭(EB)(北京鼎国生物技术有限责任公司产品);蔗糖、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、乙二胺四乙酸二钠、氢氧化钠、二甲基亚砜和盐酸等.
1.2.2 缓冲液
STN缓冲液:136.8 g蔗糖、0.6 gNaCl、4.0 gTricine,蒸馏水定容至1000 mL.
细胞裂解液:20.0 g CTAB、81.8 g NaCl、100 mL Tris-Cl、0.5 mol/L pH 8.0的EDTA 40 mL;蒸馏水定容至1000 mL.
PBS:8.0 gNaCl、3.56 gNa2HPO4、0.2 gKH2PO4、0.2 gKCl加入蒸馏水1000 mL.碱性电泳缓冲液:0.3 gEDTA、12 gNaOH,加入蒸馏水1000 mL.
1.2.3 试验材料转基因大豆育种材料(DA30),河南科技学院大豆育种教研室提供.
1.3 试验方法
1.3.1 大豆根尖原生质体制备挑选大小一致的健康种子,双氧水表面消毒,蒸馏水室温浸泡24 h,置于发芽盒中保湿发芽,待根长至1.5~2.0 cm时,分成4组(10株/组),分别置根于盛有250 mL质量浓度为0、40、80和160 mg/L草甘膦溶液中染毒处理8 h,自来水修复培养24 h;剪取根尖1 g浸于加有10 mL 1%纤维素酶和2%果胶酶的酶解液中28℃处理3 h,200目纱布过滤,5000 rpm离心3 min,沉淀用STN溶液洗2次,显微镜下观察并用PBS调整原生质体密度为每视野20~40个原生质体,供SCGE.
1.3.2 单细胞凝胶电泳电泳所用“三明治”胶板参照Rojas等法制备[12],其中0.5%NMA铺底,体积比为1∶2的0.5%LMA和根尖细胞原生质体混合液夹心,外层为0.5%LMA.外层胶凝固后,去盖玻片后放入4℃细胞裂解液中避光裂解1.5 h,用PBS冲洗2次,将载玻片置于水平电泳槽,解旋处理20 min;25 V、300 mA条件下电泳20 min,用Tris-HCl中和15 min,于每片载玻片胶面中央滴加20 μg/mL的EB溶液50 μL,避光染色20 min.
1.4 数据处理
每个视野随机选择100个细胞,计数拖尾细胞数,计算拖尾率;每张片子上随机选择50个细胞,显微拍照,记录电泳图谱,用Comet Assay Software Pect(CASP 1.2.3 beta 1)软件对彗星尾长(TL)、彗星尾部DNA含量(TDNA%)、尾矩(TM)和Olive尾距(OTM)等指标进行单因素方差分析,评价细胞DNA的受损程度.
2 结果与分析
2.1 不同浓度草甘膦处理下大豆根尖细胞的彗星图像
不同浓度草甘膦处理下大豆根尖细胞的彗星图像见图1.
图1 不同剂量草甘膦染毒处理8 h引起大豆根尖细胞DNA损伤的彗星图像Fig.1 DNAdamage comet images soybean root tip cells after 8 hours treated with different dosages glyphosate
由图1可知,对照组(蒸馏水处理组)细胞头部DNA致密,边缘较光滑,尾部不明显.所试验的草甘膦40、80和160 mg/L处理组细胞均呈不同程度的彗星形状,其头部DNA集中,亮度细较强,尾部由DNA断片组成,呈扫帚状,且随着处理浓度的加大,拖尾现象越明显.
2.2 草甘膦对大豆根尖细胞DNA拖尾率的影响
草甘膦染毒处理造成大豆根尖细胞拖尾的情况见表1.
表1 草甘膦对大豆根尖细胞DNA拖尾率的影响(n=100)Tab.1 Effect ofcomet rate on soybean root tip cells induced byglyphosate
由表1可知,不同的草甘膦处理浓度在8 h的染毒处理时间内,对照组与3个药剂处理组的DNA拖尾率分别为3.6%、37.8%、54.2%和71.6%,随着草甘膦处理质量浓度的增高DNA拖尾率呈显著上升趋势,且呈明显的剂量-效应关系.
2.3 草甘膦对大豆根尖细胞DNA的损伤
草甘膦染毒处理造成大豆根尖细胞DNA的损伤见表2.
表2 草甘膦对大豆根尖细胞DNA的损伤Tab.2 DNAdamage ofsoybean root tip cells induced byglyphosate
由表2可知,除对照组,各草甘膦处理组根尖细胞的DNA均受到明显损伤,彗星尾长、尾部DNA含量、尾距和Olive尾距显著高于对照组.且随着处理剂量的增高,尾长、尾部DNA含量、尾距和Olive尾距均显著增加,且根尖细胞DNA损伤程度与草甘膦的处理浓度呈显著的剂量-效应关系.
3 结论
一些化学、物理和生物诱突变剂或诱癌剂往往可引起DNA的损伤,DNA链断裂是细胞DNA损伤的主要类型之一.由Singh等改进和建立的单细胞凝胶电泳技术与传统方法相比,不仅操作简便、快速、灵敏,所需细胞少,适于体内、外不同类型实验和各种类型细胞DNA损伤的研究,而且能够对单个细胞的DNA损伤进行研究,从而避免了只能对细胞群体的DNA改变进行测定的不足,近年来在相关研究领域广泛应用.本研究以草甘膦对制备的大豆根尖细胞原生植体进行染毒处理,并进行了碱性单细胞凝胶电泳实验,初步证明了3个不同剂量草甘膦无论对大豆根尖细胞DNA均有不同程度的损伤,且呈明显的剂量-效应关系,但不同处理时间引起的效应还需进一步研究,同时确定大豆田的草甘膦安全施用量还有待更深入的研究.
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