人造血干细胞人源化小鼠的疝气表型分析

施海霞，陈 炜，邓 巍，梁 虹

（中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021）

本课题组利用造血干细胞囊胚显微注射法构建了人源化小鼠造血嵌合体模型，在2月龄人源化小鼠中仍可检测到人源化细胞的存在［2］，但2月龄雄性人源化小鼠中出现显著的疝气症状。本文对疝气的病因、对动物生理、行为表型及对模型应用的潜在影响进行了研究。

1 材料和方法

1.1 人造血干祖细胞制备

正常健康新生儿脐血由北京市脐带血造血干细胞库提供（孕母排除病毒性肝炎、艾滋病和梅毒感染）。脐血用肝素钠抗凝，12 h内分选。用Ficoll Paque PLUS淋巴细胞分离液（密度1.077，GE Healthcare公司）以不连续密度梯度离心，收集界面白膜层悬浮细胞即为脐血单个核细胞（MNC），MNC再经EasySep复选人造血干祖细胞（含CD41）试剂盒（stemcell公司）分选获得人造血干祖细胞。

1.2 干细胞囊胚显微注射

以3～4周龄ICR雌鼠作为囊胚供体鼠。采用PMSG和hCG进行超排处理，第2.5天取桑椹胚，KSOM液培养过夜，次日囊胚充分扩张后进行造血干细胞的显微注射，每个囊胚内注射15～20枚造血干细胞，移植入假孕鼠2.5 d子宫中。

1.3 人源化小鼠的鉴定

小鼠出生后9～14 d剪尾，碱裂解法提取基因组DNA，用人线粒体DNA特异性引物进行PCR检测：hm tDNA-FP：5＇CAC CCT ATT AAC CAC TCA CG 3＇；hmtDNA-RP：5＇ATG TCT GTG TGG AAA GCG 3＇，扩增产物大小为264 bp。反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环，72℃延伸10 min。

Michael Mauer:优秀的设计源自于“天马行空”一般的创意，但它们最终要回归到源于纪律、架构、目标等略显枯燥的细化阶段。在这个阶段，除了自由和创意，我们还需要勤奋、认真和严谨的工作态度。就像我刚才说的，设计师可以用感性的方式来创新，但也必须要具备理性的思维来实践。好的设计师就像一名经验丰富的运动员，拥有十分准确的预判技巧，也有着沉着、冷静的执行能力。设计虽然能够令人沉醉其中，但我也不否认，做一名优秀的设计师其实很辛苦。

1.4 病理学观察

小鼠断颈处死，取5只疝气症状的人源化阳性小鼠和5只野生型小鼠的腹股沟区和阴囊组织，10％中性福尔马林（neutral buffered formalin，NBF）固定，脱水，石蜡包埋，切片厚度10μm，Masson染色观察胶原纤维含量。采用特异性人CD45抗体（abcom ab8216）进行免疫组织化学染色，检测相应组织中人源化细胞的表达。

1.5 行为学检测

选用2月龄的人源化阳性和阴性雄性小鼠各9只，野生型小鼠10只，采用modified SHIRP进行行为学初筛［3］。随后采用Rota-rod转轮测试仪（UGO公司，意大利）进行小鼠运动与耐力测定，参数设置：最小速度为5 rpm，最大速度为20 rpm，加速度时间为5 min，将实验小鼠分别放到相应的跑道上，开启仪器，记录动物的爬行持续时间。最后，采用Morris水迷宫进行运动型和游泳耐力测定，水温25℃，记录动物在1m in内的游泳距离、速度和活跃期时间。

1.6 数据统计

实验结果采用平均值±SE表示，并用SPSS软件对数据进行统计，数据经正态分布和方差齐性检验后，采用独立样本t检验对人源化阳性组合野生型对照组数据进行统计，采用one-way ANOVA分析对阳性组、阴性组和野生对照组数据进行统计分析。当P＜0.05时为差异显著。

2 结果

本研究通过干细胞显微注射法将人脐血干祖细胞注射到小鼠囊胚中，成功获得了人源细胞嵌合体小鼠，嵌合体阳性率为23％［2］。在20只人源化雄性小鼠中，有90％的个体出现程度不一的疝气症状，本研究对这些疝气症状小鼠进行了病理学、生理学和行为学表型分析：

1.病理观察

我们解剖了5只2月龄以上的雄性小鼠，小鼠的体表外观上可见程度不等的阴囊肿胀，剪开疝囊，内容物包括小肠、大肠、膀胱等腹部脏器（彩插8图1），这些内容物不可回缩至腹腔。

镜下Masson染色显示，与野生型小鼠相比，人源化嵌合体小鼠腹膜腹股沟区致密结缔组织减少（彩插8图2）。但免疫组化研究结果表明，这些病变组织中不存在人源化细胞。

2.睾丸系数与血液激素含量

人源化嵌合体阳性和阴性及野生型雄性小鼠的睾丸系数（F2，10=2.982，P=0.108）、血液睾酮（F2，10=0.009，P=0.991）和皮质酮（F2，10=0.008，P =0.992）浓度之间均无显著差异。

表1 人源化小鼠繁殖系统功能Tab.1 Mean values of reproductive system function

3.运动行为学

对人源化小鼠行为学初筛表明，在尾巴姿势和反抗行为这两个指标上，人源化小鼠、人源化阴性小鼠和野生型小鼠之间具有显著差异（尾巴姿势：F =3.571，P=0.043；反抗行为：F=3.551，P= 0.044），其中，人源化小鼠的尾巴姿势得分显著高于野生型小鼠（P=0.014），人源化小鼠尾巴上翘的比例高于野生型小鼠，这可能是因为阴囊肿大引起的尾巴姿势变化，而不代表动物的应激性升高。人源化小鼠的逃逸行为（P=0.03）和反抗行为（P =0.015）显著低于阴性嵌合小鼠。人源化小鼠的正位反射（P=0.034）高于野生型小鼠。人源化小鼠的抓力（P=0.027）显著低于野生型小鼠，表明小鼠的后肢运行协调性下降（表2）。

在Rota-rod转轮实验中，各组之间具有显著差异（F2，25=4.330，P=0.024）。其中，阳性和人源化阴性小鼠在转棒上的运动持续时间均显著低于野生型小鼠（P=0.03；P=0.012）。

各组小鼠在游泳距离（F2，26=3.572，P= 0.043）、速度（F2，26=3.546，P=0.043）上具有显著差异，人源化小鼠的游泳距离和速度显著低于野生型小鼠（P=0.014）而各组小鼠的活跃期时间（F2，26=1.373，P=0.271）无显著差异。

表2 Modified SHIRPA行为学实验结果Tab.2 Behavior anaylsis in modified SHIRPA

表3 Rota-rod转轮实验Tab.3 The Rota-rod Test

3 讨论

耻骨肌孔（myopectineal orifice）是一个位于腹股沟区的卵圆形裂孔，仅以一层腹横筋膜结缔组织抵抗腹腔内压力，这部位区域的薄弱会引起疝气形成［4］。本研究表明人源化小鼠腹股沟区致密结缔组织减少，致密结缔组织是筋膜鞘的主要组分，因此致密结缔组织的减少可能是疝气形成的直接原因。并且，疝气仅在2月龄以上成年雄性个体中发生。因此，人源化小鼠疝气表型属于直接性腹股沟疝。

研究发现睾丸和精索由腹股沟管下降到阴囊的过程受雄激素的调节，儿童可因疝气的挤压而影响睾丸的正常发育［5，6］。本研究结果表明人源化小鼠的疝气症状不影响睾丸的大小和功能，疝气发生与睾酮变化无显著相关性，这与人类男性腹股沟疝的发生与雄激素变化无关的结果相一致［7，8］。而在形成间接腹股沟疝的Insl3转基因小鼠中，鞘状突的形成与雄激素介导的睾丸引带外突也无相关性。

人类疝气患者具有易疲劳和体质下降等症状。本研究也发现，造血干细胞人源化小鼠的运动机能和耐力均显著下降，但与运动兴奋性相关的皮质酮激素含量却无显著变化。以往对人源化小鼠的相关研究发现，恒河猴骨髓间充质干细胞嵌合体小鼠在悬尾实验时具有四肢抱拢的反常现象［9］。而在本研究中，modified SHIRPA行为观察发现，人源化小鼠的正位反射高于野生型小鼠，即悬尾状态下动物头部抬起概率增加。这与上述现象不同，但均说明嵌合体小鼠的神经系统或运动系统中存在某种异常反射。提示在神经系统或运动系统中有异源动物细胞嵌合，灵长类与小鼠神经细胞及神经系统反射机制的巨大差别可能是前述现象发生的原因。

异种动物造血嵌合体模型在人造血干细胞体内生物学特性、人类免疫相关疾病及其它应用研究方面具有巨大的应用潜力。目前常见的重症联合免疫缺陷小鼠干细胞移植系统在人类免疫系统功能塑造方面存在一定局限。在免疫系统尚未成熟的胚胎发育早期进行的人源干细胞显微注射嵌合体小鼠是方法学上的一种新突破，对这种人源化小鼠的表型分析是该模型进一步应用的基础，本研究结果表明人源化小鼠的疝气表型对于小鼠运动性和耐力具有显著抑制，但不影响小鼠的繁殖系统功能。

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