马先蒿无性系建立的研究

李冬雪，高 珂，宋诗迎，徐 娜，姜长阳

（辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁 大连 116081）

1 引言

马先蒿（Pedicularis resupinata）属于玄参科，多年生草本植物，生长于草地、林缘、湿草甸子、针叶林下、山坡灌丛中和杂木林等环境中［1，2］，在我国的辽宁等地区有分布［3］，近年来也有栽培［4］。马先蒿是一种药用植物，具有多种药用价值［5］。近年来，有关园艺工作者在对辽宁地区的野生植物进行调查研究时发现，分布于辽宁南部的马先蒿，具有株型美观、花色美丽、花期较长、抗逆性较强等特点，适于进行观赏栽培。但是，由于多年来人们大量的采集药用，野生马先蒿的数量已很稀少，难以通过直接挖取野生的植株进行观赏栽培。同时，由于马先蒿在野生条件下结种数很少，也使其无法通过采集的种子进行繁殖。为此，研究者采用组织培养的方法建立马先蒿的无性系，以期满足人们栽培的需要。虽然已有马先蒿研究的报道［6，7］，但迄今未见马先蒿组织培养及无性系建立研究的报道。

2 材料与方法

2.1 材料

将大连甘井子区岔鞍山林下生长旺盛的马先蒿植物采回实验室，作为研究材料。

2.2 材料灭菌

参见王艳等［8］艾蒿研究的灭菌方法进行灭菌，即可获得无菌嫩茎。

2.3 培养条件

参见张卓等［9］山苦菜研究的培养条件进行培养研究。

2.4 方法

2.4.1 愈伤组织的诱导及分化

将无菌嫩茎切成长0.2～0.3cm的茎段（下称嫩茎），将叶柄基部的生长点切成长0.1cm具有生长点的茎段（下称生长点），将叶片切成边长0.3cm的块状（下称叶片）后，接种于 MS＋6－BA0.6mg·L－1＋2，4－D2.0mg·L－1和 MS＋6－BA0.6mg·L－1＋2，4－D1.0mg·L－1＋NAA0.3mg·L－1两种培养基上，进行不同材料愈伤组织的诱导培养试验。将获得的愈伤组织在培养瓶内继续培养50d，观察愈伤组织的分化情况。愈伤组织诱导培养试验重复2次，每种处理接种100个材料。

2.4.2 生根培养

将以上由生长点诱导的愈伤组织分化培养的不定芽从基部切下，接种到以1／3MS为基本培养基，附加不同浓度的NAA、IAA、IBA和ABT2号（下称ABT）生长调节剂，进行不定芽的生根培养。不定芽生根培养试验重复4次，每种处理接种100个不定芽。

2.4.3 试管苗移栽与定植

将进行着生根继代增殖培养的试管苗从培养瓶中取出，置于底部有一层厚约0.2～0.4cm水层的搪瓷盘中，在光照下炼苗2d后，移栽到上层为6～7cm干净河沙、下层为肥沃园土的温室苗床中，进行试管苗的移栽试验。移栽试验重复3次，移栽株数分别为200株、400株和600株。

把移栽成活的试管苗于6月20日和30日，分2次定植到大连市区的花坛上，2次共定植1 100株。

3 结果及分析

3.1 不同材料、不同培养基对愈伤组织诱导和分化的影响

培养45d统计，结果见表1。由表说明，以叶片为材料，在两种培养基上均不能诱导培养出愈伤组织；以生长点和嫩茎为材料，在两种培养基上都能诱导形成愈伤组织，其中生长点的培养效果好于嫩茎。以生长点为材料，不仅诱导率最高，而且培养的愈伤组织长势旺盛。由对培养过程的观察可知，以生长点为材料，培养8～10d，有的材料开始生长愈伤组织，之后，随着生长愈伤组织数量的不断增加，愈伤组织也在不断地生长。初期生长的愈伤组织为黄绿色，后来为由许多大小不等绿色颗粒组成的半球状。把在两种培养基上由生长点和嫩茎培养的愈伤组织继续培养40d，并对培养过程进行观察统计。观察证明：由嫩茎培养的愈伤组织不分化；以生长点为材料在 MS＋6－BA0.6mg·L－1＋2，4－D2.0mg·L－1培养基上诱导培养的愈伤组织不分化，而在 MS＋6－BA0.6mg·L－1＋2，4－D1.0mg·L－1＋NAA0.3mg·L－1培养基上培养的愈伤组织能分化出不定芽。继续培养10d左右可见愈伤组织的上部分化出绿色的芽点，随后，芽点逐渐生长为不定芽。继续培养到40d时，平均每块愈伤组织上能分化出2.8个高0.8cm左右的不定芽。不定芽具有4～6个叶片，呈绿色，生长较旺盛。2次重复试验的结果基本一致。以上结果说明，MS＋6－BA0.6mg·L－1＋2，4－D1.0mg·L－1＋NAA0.3mg·L－1培养基是马先蒿生长点愈伤组织诱导和分化培养的理想培养基。

表1 不同材料对愈伤组织诱导的影响

3.2 不同浓度调节剂对不定芽生根培养的影响

接种培养到30d时观察统计，结果见表2。在不加生长调节剂的培养基上，不定芽不能生根；在附加4种生长调节剂的培养基上，不定芽均能生根并生长为试管苗；其中加ABT10mg·L－1的培养基上生根率最高，达到了96%，并且试管苗长势旺盛。观察表明，将不定芽接种到附加ABT 10mg·L－1的培养基上培养到4d时可见生长出白色的根原基，随后，生根数不断增加，根原基很快生长为白色的根，培养到30d时生根率为96%、生根数为7.6条／株、株高4.1～5.3cm，并且试管苗长势旺盛。把在1／3MS＋ABT 10mg·L－1这种培养基上生根培养的试管苗剪成长1.5cm左右、具有2个生长点的不定芽，接种到相同的培养基上进行试管苗的生根继代增殖培养，28d为一个生根继代培养周期，可培养出一代与以不定芽为材料经过30d生根培养长势一致的试管苗，生根率为98.5%，每一代的增殖系数为2.9。生根继代增殖培养连续培养了6代，其结果基本一致，4次重复试验的结果也基本一致。以上结果说明：1／3MS＋ABT 10mg·L－1这种培养基是马先蒿不定芽生根培养和试管苗生根继代增殖培养的理想培养基。

表2 不同浓度生长调节剂对不定芽生根培养的影响

3.3 试管苗移栽与定植

移栽8d左右可见试管苗开始生长，30d时统计，分别成活182株、373株和566株。共成活1 121株，平均成活率为93.4%，成活率较高。

定植后30d统计证明：共成活1 082株，定植成活率为98.5%。这说明，在温室中移栽成活的试管苗，容易定植成活。

对定值成活的试管苗的观察表明：定植成活的试管苗不仅保持了野生马先蒿叶色浓绿，生长旺盛，根系约为野生同龄植株的1.5倍，当年不开花、翌年7月中旬开花、8月结果等植物学性状，还保持了株型美观、花色美丽、花期较长、抗逆性较强等有利于观赏的特点。

4 结语

本研究定植的马先蒿试管苗不仅保持了野生马先蒿的植物学性状，而且还保持了株型美观、花色美丽、花期较长、抗逆性较强等有利于观赏的特点。这一结果说明：本研究所获得的试管苗可作为观赏栽培的种苗使用，所建立的培养技术也为该物种种质保存奠定了技术基础。

在本研究的试管苗生根继代增殖培养中，28d为一个培养周期，每个培养周期的增殖系数为2.9。按照这种繁殖速度，一株试管苗每年可以繁殖出2.913（约为99万）株试管苗。除掉各种不利因素影响，每年完全能保证繁殖出50万株试管苗，这种繁殖速度完全能满足栽培对种苗的大量需求。

［1］韩全忠，王振兴.大连地区植物志（中册）［M］.大连：大连理工大学出版社，1993：673.

［2］中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴（第四册）［M］.北京：科学出版社，1975：71.

［3］李书心.辽宁植物志（下册）［M］.沈阳：辽宁科学技术出版社，1991：336.

［4］包满珠.花卉学［M］.北京：中国农业出版社，2004：431～414.

［5］南京中医药大学.中药大辞典（上册）［M］.上海：上海科学技术出版社，2008：394.

［6］王 静，唐 王.马先蒿属野生花卉引种的可行性研究［J］.中国林副特产，2005（1）：5～7.

［7］王 薇，邹艳敏，张 莉.马先蒿属植物的现代研究进展［J］.西北药学杂志，2006，21（3）：142～144.

［8］王 艳，张 卓，王晓旭，等.艾蒿生长点及试管苗培养的研究［J］.辽宁大学学报，2011，36（4）：353～357.

［9］张 卓，王 艳，李 慧，等.山苦菜无性系建立的研究［J］.河南大学学报，2012，42（2）：187～191.