固醇携带蛋白2腺病毒载体的构建与鉴定

贾岩峰，崔云峰，崔乃强，彭雁飞，宁召臣，张 琚

固醇携带蛋白2腺病毒载体的构建与鉴定

贾岩峰1，崔云峰2，崔乃强2，彭雁飞3，宁召臣3，张 琚3

目的：构建携带白蛋白启动子SCP2基因腺病毒载体，研究其与胆固醇结石形成的关系。方法：（1）利用RT-PCR技术克隆小鼠SCP2基因，在其上游接入白蛋白（ALB）启动子，下游连接绿色荧光报告基因（EGFP），构建穿梭质粒pDC312-ALB-SCP2-IRES2-EGFP；（2）采用Ad Max TM Adenoviru5 Vector系统包装病毒，CsCl法纯化病毒、TCID50法测定滴度；（3）重组腺病毒感染小鼠hepa-1-6细胞，实时定量PCR检测mRNA的表达；Western印迹检测SCP2蛋白表达情况；结果：成功构建携带白蛋白启动子SCP2基因腺病毒载体；当SCP2基因过表达时，CYP7a1基因表达下调，（t=3.97，P＜0.05）HMGCR基因基因表达上调，（t=3.23，P＜0.05）。结论：当SCP2基因过表达时引起HMGCR、CYP7a1基因转录水平的变化，提示SCP2基因可能通过影响胆固醇和胆汁酸的代谢而参与胆固醇结石的形成。

SCP2基因；白蛋白启动子；腺病毒载体；胆固醇结石

胆固醇结石的发病主要涉及到三个经典病理过程：即胆汁中胆固醇的过饱和、胆囊运动障碍和成核缺陷。国内外学者们一直在努力寻找引起胆囊结石病的致石基因，其中胆固醇携带蛋白2（sterol carrier protein 2，SCP2）是影响肝细胞中游离胆固醇浓度的重要因素，并且SCP2基因在哺乳动物中具有高度保守性[1]。国外文献报道[2]SCP2基因与胆固醇结石的形成有关，我们将构建携带肝特异性白蛋白（ALB）启动子SCP2基因的腺病毒载体，探讨SCP2基因与胆固醇结石发生的关系。

1 材料与方法

1.1 主要材料 AD293 T细胞和Hepa1-6细胞及质粒pIRES2-EGFP由南开大学生物分子研究所保存。白蛋白启动子质粒（pmALB）由华东师范大学生命科学院张满仓教授惠赠。限制性内切酶、碱性磷酸酶、载体pMDTM18T、DNA连接酶及 AdMaxTM Adenoviru5 Vector Kits（包括穿梭质粒pDC316、pDC312和载体质粒BPHG1ox△E1，3Cre），购于Ta-KaRa公司。高保真酶Prime STARTMHS DNA Poly-merase，购于 Promega公司。Invitrogen Lipofectamine 2000转染试剂购于INVITRAGEN公司；RPMI l640基础培养液、DMEM基础培养液购于HyC lone公司；山羊抗小鼠SCP2一抗（SANTA CRUZ），兔抗山羊IgG，HRP(CWBIO)。引物由上海生物工程公司合成。

1.2 穿梭质粒pDC312-ALB-SCP2-IRES2-EGFP的构建 取C57BL/6小鼠肝组织按Trizol法提取总RNA，逆转录合成cDNA。设计带有特异性的酶切位点引物，P1ACA GGA TCC AGA GGG GAC AAC ACT TAC(BamH I)，P2 AAA GGT ACC CAA AGG GAC TCC TCA CAG(Kpn I)，克隆SCP2基因cDNA序列。接着将白蛋白启动子（ALB）接入小鼠SCP2基因上游，以质粒pmAlb-SCP2为模板PCR法扩增SCP2片段，进行PCR、酶切及测序鉴定。然后扩增IRES2-EGFP片段，并连接于质粒pDC312上，构建质粒pDC312-IRES2-EGFP。最后以pmAlb-SCP2为模板，扩增ALB-SCP2片段，将ALB-SCP2片段插入质粒pDC312-IRES2-EGF构建穿梭质粒pDC312-ALB-SCP2-IRES2-EGFP。

1.3 重组腺病毒的制备 DMEM基础培养液加5%胎牛血清（FBS）于37℃含5%CO2培养箱中培养AD293细胞约60%融合时，将质粒pDC312-ALBSCP2-IRES2-EGFP和pDC316与腺病毒基因组质粒pBHGlox△El，3Cre，按 Lipofectamine2000使用说明书的方法共转染AD293细胞，12 d细胞发生完全病变后，收获细胞。于-80/37℃反复冻融3次裂解细胞，12 000 rpm离心10 min收取上清，即为初代病毒液，命名为Adscp2和Adnull。收集4轮扩增的病毒上清，CsCl梯度离心法纯化病毒，采用TCID50法测定滴度，确定最佳感染复数（MOI），本实验为100 MOI。

1.4 实时荧光定量PCR检测基因的mRNA表达情况 RPMI l640基础培养液加10%FBS培养小鼠Hepa1-6细胞至80%融合时，以100 MOI腺病毒感染细胞。24 h后提取总RNA并反转成cDNA。采用SYBR Green I实时定量PCR检测SCP2、HMGCR、CYP7a1基因mRNA的表达情况。引物序列：SCP2，P15'-CAGGACGCACCAGGTTTC-3'，P2 5'-TCC AGG GCC ATC TTT CAC-3'；HMGCR，P1 5'-TGT TCA CGC TCA TAG TCG C-3'，P2 5'-TCA GGG TAA TCA CTT GCT CAA T-3'；CYP7a1，P1 5'-AAT GCT CCA TTC ACT TCT TCA-3'，P2 5'-AGG CTA AGA CGC ACC TCG-3'；GAPDH，P1 5'-GGG CAT CTT GGG CTA CAC-3'，P2 5'-GGT CCA GGG TTT CTT ACT CC-3'。

1.5 Western-Blotting检测SCP2蛋白 小鼠Hepa-1-6细胞培养至80%融合时，以100 MOI腺病毒感染细胞48 h后提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量。以40 μg蛋白上样，12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移至PVDF膜。TBST洗膜，5%兔血清封闭。SCP2一抗1∶500，GAPDH一抗1∶5000，4 ℃孵育过夜；二抗1∶5000室温孵育1 h，TBST洗膜后采用化学发光法检测，结果以SCP2/GAPDH光密度的相对值表示。

1.6 统计学分析 借助SPSS 16.0完成统计分析。实时定量PCR以2-ΔΔCT法处理计算相对值，数据以均数±标准差（±s）表示。两样本均数比较采用t检验，P＜0.05时，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 穿梭质粒的鉴定 利用RT-PCR克隆小鼠SCP2基因编码序列，片段长621 bp，琼脂糖凝胶电泳检测结果（图1A），且经测序证实SCP2cDNA序列完全正确。质粒pmAlb-SCP2经ScaI酶切得到两个片段位置在3.3 kbp和2.6 kbp附近，经HindIII酶切得到两个片段位置在3.5 kbp和2.4 kbp附近；片段大小正确，说明白蛋白启动子（ALB）成功接入SCP2基因上游（图1B）。质粒PDC312-IRES2-EGFP经HindIII酶切得到约1.6 kbp和3.3 kbp两个片段(图1C)。质粒PDC312-ALB-SCP2-IREC2-EGFP经ScaI酶切鉴定得到两个约2.9 kbp和5.8 kbp片段，经BglII酶切鉴定得到两个约1.7 kbp和7.0 kbp片段，各个片段大小正确，证实质粒构建成功(图1D)。

2.2 重组腺病毒的制备 正常AD293细胞多为梭形或多角形，胞体较小（图2A）。穿梭质粒与pBHGlox△El，3Cre以脂质体介导共转染AD293细胞后，AD293细胞出现病变效应（CPE）。转染后5～8 d，AD293细胞开始出现病变，大部分细胞肿胀、增大、变圆、部分细胞空泡化，转染后10～12 d，细胞完全出现病变，大量细胞脱壁而浮起呈葡萄珠状(图2B)。经过4轮扩增纯化后的腺病毒Adnll和Adscp2滴度分别为T1=2.0×1011TCID 50/mL，T2=2.6×1011TCID 50/mL。小鼠Hepa1-6细胞呈梭形贴壁生长（图2C）,以 Adscp2腺病毒感染细胞48 h可以看到绿色荧光（图2D），96 h荧光最强，可持续观察5 d荧光。

2.3 实时PCR检测基因的mRNA表达情况 以100MOI腺病毒 Adnull和Adscp2感染Hepa1-6细胞24 h后提取RNA，采用SYBR Green I实时定量PCR检测。结果显示：SCP2基因mRNA表达量约是对照组的170倍，t=96.91，P＜0.05，差异有统计学意义（图3A）。当SCP2基因过表达时，CYP7a1基因表达下调约2倍，t=3.97，P＜0.05；HMGCR基因表达上调约2倍，t=3.23，P＜0.05（图3B），差异有统计学意义。

2.4 SCP2蛋白的表达 小鼠Hepa-1-6细胞培养至80%融合时，以100MOI腺病毒感染细胞48 h后提取总蛋白。Western印迹检测SCP2蛋白的表达，结果以SCP2/GAPDH光密度的比值表示Adscp2：0.61±0.03；Adnull：0.07±0.01；二者比较t=88.73，P＜0.05，差异具有统计学意义（图4）。

3 讨论

固醇载体蛋白SCP2，主要位于过氧化物酶体，被认为是胆固醇代谢途径中重要的载体蛋白，且在体外组织培养系统SCP2能够影响胆固醇的运输[3]。目前发现的固醇携带蛋白主要有SCP2(sterol carrier protein-2)、前SCP2(pro-sterol carrier protein-2)和SCPx(sterol carrier protein-x)3种[4]，其中研究最多的是SCP2，它在胆固醇代谢中起重要的调节作用，成为胆囊胆固醇结石疾病研究的热点。Ito等[5]最先发现胆固醇结石病人肝脏SCP2含量较对照组明显升高，才使得医学界将SCP2与胆囊胆固醇结石联系起来，并开始从分子生物学角度认识SCP2，探索致石性胆汁形成的原因。SCP2，一方面作为胆固醇代谢的调节因子，参于胆固醇的生物合成和胆固醇向胆固醇酯、胆汁酸及类固醇激素的转化；另一方面作为胆固醇转运器，参与细胞内、质膜间的胆固醇的运输。国内外研究报道[6-8]SCP2与胆固醇的代谢和胆固醇结石的形成有关；我们前期的研究[9-12]也证实SCP2基因参与胆固醇结石的形成，但确切的机理尚不十分清楚。

我们应用ALB启动子启动SCP2基因，来探讨其与胆固醇结石的关系。一方面由于ALB启动子引导的外源基因表达所引起的体液免疫及细胞免疫反应均较轻，基因治疗的重复性好[13]；另一方面由于ALB启动子可克服因启动子失活而导致的转基因沉默现象，使基因治疗的有效期增加[14]。同时，我们选用腺病毒载体，是因为：⑴腺病毒载体对外源基因表达水平高，且能同时表达多个基因；⑵插入外源基因容量大，达8.0kb左右；⑶不整合到染色体中，无插入致突变性；4）病毒滴度高，制备纯化相对容易；⑸目前商业化腺病毒载体系统大大提高了细菌内同源重组效率，使操作过程大大简化；⑹腺病毒本身具有一定的嗜肝性，血循环中的重组腺病毒更容易感染肝细胞从而使其外源基因的表达水平较其他脏器或组织为高[15,16]。我们经过腺病毒的包装、扩增与纯化得到了高滴度的病毒，足以满足体内和体外的试验。而且，我们通过感染小鼠Hepa1-6细胞观察绿色荧光蛋白间接验证病毒和通过Western印迹检测SCP2蛋白直接验证其功能。与对照比较，SCP2蛋白表达升高说明腺病毒构建成功。这为我们将在动物水平进行转基因实验研究奠定了基础。

羟甲基戊二酸单酰CoA（HMGCoA）还原酶为胆固醇合成的限速酶，其活性升高促进胆固醇的合成，活性降低胆固醇的合成减少；而胆固醇7a（CYP7-a）羟化酶是胆汁酸合成的关键酶，其活性增加促进胆固醇转化为胆汁酸，是胆固醇代谢的主要去路。人类研究发现CYP7a1缺乏时能促进胆固醇结石的形成[17]，而CYP7a1转基因小鼠能够抵制胆固醇结石的形成[18]。我们的研究发现SCP2基因过表达时，HMGCR基因表达升高、CYP7a1基因表达下调。我们认为SCP2过表达时，（1）增加了胆固醇向胆汁的转运；（2）提高了HMGCR酶的活性进而增加了肝胆固醇的合成；（3）降低了CYP7a1酶的活性从而减少了胆固醇向胆汁酸的转化，影响了胆固醇的排泄。这些因素的共同作用将使得胆汁中胆固醇的饱和度增加而形成结晶，有助于胆固醇结石的形成，但其具体机制有待进一步研究。

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Expression of Mouse SCP2 Gene Adenoviral Vector Carrying Albumin Promoter in Hepa1-6 Cells

JIA Yan-feng,CUI Yun-feng,CUI Nai-qiang,et al.Tianjin Medical University,Tianjin(300070),China.

Objectives To construct the replication defective adenoviral vector of SCP2 gene carrying mu⁃rine albumin promoter,and study the relations between SCP2 gene and the formation of cholesterol calculus.MethodsThe cDNA of SCP2 gene was cloned by using RT-PCR technique.The albumin promoter was linked to SCP2 gene’s upstream,and the EGFP gene lied in its downstream.The plasmid pDC312-ALB-SCP2-IRES2-EGFP was constructed by the gene recombination technique.The Admax Adenoviral Vector System was used to generate the replication defective adenoviral vectors,which were purified by CsCl method.The processes of TCID50 were applied to detect the titers of the adenoviral vectors.The RNA and protein were respectively ex⁃tracted from the infected Hepa1-6 cells by the adenoviral vector.The real-time quantitative PCR was employed to detect the mRNA expression levels,and the Western blotting analysis was used to measure the SCP2 protein levels. Result We constructed successfully the replication defective adenoviral vector of SCP2 gene carrying murine albumin promoter.When the mRNA levels of SCP2 gene were overexpressed,CYP7a1 mRNA levels were down-regulated(t=3.97，P＜0.05);and the mRNA levels of HMGCR were up-regulated(t=3.23，P＜0.05).ConclusionsThe SCP2 gene overexpression may affect cholesterol and bile acid metabolism,which could promote the formation of cholesterol calculus.

SCP2 gene;Albumin promoter;Adenoviral vector;Cholesterol calculus

Q95-33；Q782

A

1007-6948(2012)03-0269-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2012.03.015

天津市自然科学基金资助项目(08JCYBJC08700)

1.天津医科大学研究生院（天津 300070）

2.天津市南开医院

3.天津南开大学生物分子研究所

崔乃强，E-mail：nctsui@126.com

（收稿：2012-05-02 修回：2012-05-16）

（责任编辑 屈振亮）