递增负荷有氧运动对老龄雌性大鼠心肌抗氧化酶及心肌线粒体超微结构的影响

雷志军，郑 澜，凡 婷，陈伊琳，林丽容

心脏结构和功能的增龄改变是心脏病发生的主要危险因素，这类疾病已严重影响中老年人群的健康和生存质量。衰老的自由基学说认为，自由基是导致机体衰老的主要原因，并可导致与衰老相关疾病的发生[1]。已有研究表明，适宜的运动能提高机体内源性抗氧化酶活性，延缓衰老[2,3]。线粒体是ATP和自由基生成的主要场所，线粒体形态结构的改变是其功能改变的可见形式，对线粒体形态学的研究能弥补酶的生化测定的不足[4]。本研究探讨规律有氧运动对老龄大鼠心肌抗氧化酶活性和线粒体超微结构的影响，旨在说明有氧运动对心脏自然衰老过程中心肌增龄改变的影响。

1 实验材料和方法

1.1 实验对象及分组

健康雌性18月龄Sprague-Dawley大鼠30只，体重460.5g±59.3g(由南华大学医学院实验动物学部提供)，随机分为2组：老龄运动组和老龄对照组，每组15只；另安排一组3月龄Sprague-Dawley大鼠为年青对照组(取材时临时购进)，体重约为180.4 g±46.5 g，共10只。国家标准啮齿类动物饲料喂养，自由进食、进水，室温23℃±2℃，相对湿度55%±5%，自然光照。所有动物在实验前均未进行过跑台运动。

1.2 训练方案

大鼠经适应性运动后，采用递增负荷跑台运动，起始速度为15m/min，时间为15min，以后按照先增加运动时间再增加运动强度的原则依次进行递增，运动时间增加幅度为5min，跑速增加幅度为1m/min，每一负荷持续时间为一周，每周训练6次，最后两周运动负荷维持不变，直至本实验结束。每天下午4点30开始运动，星期天休息。

1.3 取材和指标的测定

训练结束后12h内，实验大鼠用1%戊巴比妥钠按50mg/Kg深度麻醉，暴露胸腔，迅速取出心脏，浸入4℃生理盐水中洗净残余血液，剔除心包和心外膜，用小剪刀剪碎，置液氮中贮存备用。每组随机抽取三只实验大鼠，在心尖部取一小份心肌组织(1mm左右)，置于2.5%戊二醛磷酸缓冲液，用于制备电镜检测标本。

1.3.1生化指标测定心肌组织块常温解冻，滤纸拭干，取心肌组织(0.2g～1g)滤纸吸干，加入液氮碾磨成白色粉末，用0.86%冷生理盐水，制备成10%心肌组织匀浆液，震荡混匀。以2 500r/min速度4℃离心10min，取上清液分别用于丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX-Px) 的测定。MDA、SOD、CAT 和GPX-Px酶试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供，严格按试剂盒要求进行操作。

1.3.2电镜标本制取取出的心肌组织用2.5%戊二醛磷酸缓冲液预固定，0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗三次，1%锇酸缓冲液后固定，0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗三次，丙酮逐级梯度脱水，环氧树脂(Epon) 812包埋，半薄切片光学定位，然后制成超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色。用日立(HITACHI)H-7500透射电子显微镜20 000倍下观察，德国奥林巴斯CCD系统拍照。

1.4 数据统计

2 实验结果

2.1 运动对实验大鼠心肌抗氧化酶活性的影响

老龄运动组大鼠较老龄安静组大鼠心肌SOD、GSH-Px活性显著增加(P<0.05)，老龄对照组大鼠心肌SOD、GSH-Px活性较年青对照组大鼠显著下降(P<0.01)；老龄对照组大鼠CAT较年青对照组大鼠存在显著降低(P<0.05)，老龄运动大鼠与老龄对照大鼠CAT活性无显著性差异(见表1)。

表1 实验大鼠心肌组织氧化抗氧化能力测试结果

注：与年青对照组大鼠比较，“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01；与老龄对照组大鼠比较，“#”表示P<0.05；“##”表示P<0.01。

2.2 运动对实验大鼠心肌MDA含量的影响

老龄运动组大鼠较老龄对照组大鼠MDA含量显著下降(P<0.05)，老龄对照组大鼠较年青对照组大鼠MDA含量显著下降(P<0.01)(见表1)。

2.3 运动对实验大鼠心肌线粒体形态学观察结果

年青对照组大鼠心肌线粒体排列有序，线粒体完整性好，未见空泡或肿胀(见图1A)；老龄对照组大鼠心肌线粒体出现内室肿胀，表现为不同程度的空化，部分出现灶性空化，嵴减少，形成较宽的电子透亮区，个别线粒体因高度肿胀出现界膜破裂、线粒体崩解(见图1B)；老龄运动组大鼠心肌线粒体少数出现较小内室肿胀，但未见界膜破损(见图1C)。

A：年青对照组大鼠心肌线粒体排列有序，线粒体膜完整(20 000)；B：老龄对照组大鼠心肌线粒体内室有不同程度空化，膜可见破裂(20 000)；C：老龄运动组大鼠心肌线粒体内室有较小肿胀，膜未见破裂(20 000)

图1大鼠心肌组织线粒体超微结构的变化

3 分析与讨论

心脏主要通过有氧代谢供能，是机体中耗氧率最高的器官之一。心肌线粒体氧化供能的同时也释放出自由基，构成线粒体电子传递链中必须的中间环节。SOD是机体主要的抗氧化酶。本研究发现，老龄运动大鼠心肌中SOD较老龄不运动大鼠的显著提高，表明在有规律的有氧运动刺激下，机体自由基含量增多，诱导性地增加了心肌中SOD的活性。SOD活性增强不仅有利于机体及时清除O2·-，避免O2·-对细胞膜的损伤或者透过细胞膜上的阴离子通道，对细胞核也能造成进一步的损害[5]。CAT和GSH-Px同为清除H2O2的酶，老龄运动组大鼠心肌GSH-Px活性增强，而CAT没有统计学意义的改变，表明运动中心肌H2O2的清除主要由GSH-Px发挥抗氧化作用，这可能是因为在正常大气压氧下GSH-Px的活性最高，比SOD高1 478倍，比CAT高36倍，与这两种酶的生物活性有关[6]。MDA含量出现随龄增多的趋势，表明机体脂质过氧化加重。运动组老龄大鼠相比安静组老龄大鼠心肌MDA含量下降，说明规律的有氧运动能有效降低心肌脂质过氧化程度。

线粒体是细胞内氧化、储能和供能的主要场所，同时也是细胞内自由基产生的主要场所，其产生的ROS占机体ROS总量的90%以上[7]。线粒体结构的完整是其功能正常发挥的保障，线粒体超微结构的改变，如肿胀、脊断裂和空泡化等，可引起线粒体能量代谢失衡，ATP酶活性发生改变，钙离子稳态失调等系列功能的变化[8]。线粒体肿胀通常被看作是细胞损伤或老化的表现，而线粒体崩解则是细胞衰老变化的重要标志[4]。运动时机体耗能大幅增加是导致其超微结构改变的重要原因[10]。本研究结果显示，老龄大鼠与年青大鼠相比，心肌线粒体膜破损，线粒体嵴减少、断裂，而规律的有氧运动能使线粒体随增龄的超微结构改变得到改善。线粒体膜和嵴的完整性能提高能量转换的效益，保持线粒体呼吸链的通畅，避免因呼吸链活性受阻引起ROS生成进一步增多和积聚，从而引起线粒体内膜氧化损伤，降低膜流动性、导致膜脂质降解等。本实验中运动组老龄大鼠心肌线粒体较不运动对照组老龄大鼠完整性好、损伤程度低，这可能是长期有氧运动提高心肌抗氧化酶活性，减少ROS对线粒体膜的损伤，是适宜运动延缓心肌衰老的表现之一。

4 结论

(1)长期有规律地进行有氧运动，能提高老龄大鼠心肌抗氧化酶活性，降低老龄运动组大鼠心肌MDA含量，保护心肌组织因衰老而导致的自由基的损害，延缓心肌衰老。

(2)长期有规律地进行有氧运动，能改善老龄大鼠心肌线粒体结构，保护线粒体膜和嵴的完整性，延缓心肌线粒体因衰老而导致的退行性变化。

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