RT-SHIV rt基因单拷贝PCR扩增方法的建立及初步应用

鞠 斌，王 卫，丛 喆，姚 南，陈 霆，杜文达，苏爱华，高锡强，魏 强

(中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

RT-SHIV嵌合病毒［1］包含逆转录酶抑制剂靶点，是艾滋病新药研究中的重要靶病毒［2］。准确了解RT-SHIV病毒rt基因的具体序列信息，对于病毒体内复制动力学和耐药突变研究具有重要意义［3］。

传统PCR方法获得的目的片段为混合产物，来源于不同的病毒拷贝，且存在模板选择等问题，无法反映出体内病毒变异的真实情况。单拷贝 PCR是近年来新兴的一种PCR方法［4］，通过扩增模板的减少来避免序列选择和重组的发生，能全面地了解体内病毒序列。然而，目前应用于单拷贝扩增全长rt基因的方法尚未建立，影响了相关研究的深入进行［5］。本研究拟建立一种单拷贝 PCR方法，扩增RT-SHIV病毒的全长rt基因，用于病毒体内复制相关实验研究。本研究将填补病毒全长 rt基因相关研究的空白，并且所建立的方法能够应用于各类RT-SHIV和 RT/env-SHIV嵌合病毒，以及 SIV病毒，具有广泛的应用价值。

1 材料和方法

1.1 质粒

以含有SIVmac239全长病毒的质粒为骨架，替换进HIV-1rt基因，构建的RT-SHIV全长病毒质粒(本实验室构建，未发表)。NanoDrop 2000微量紫外分光光度计(Thermo)测定RT-SHIV全长质粒的浓度，依据公式：

其中，MW=DNA碱基数(bp)×660daltons/bp

计算拷贝数，将质粒进行10倍系列梯度稀释，获得一系列模板浓度。

1.2 血浆样品

RT-SHIV感染猴血浆(本实验室储存)。应用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)提取病毒RNA，实时荧光定量 PCR［6］计算拷贝数约为 300copies/m L。

1.3 设计并优化rt基因特异性扩增引物

使用Oligo软件设计6对扩增引物，见表1。

筛选rt基因特异性扩增引物，PCR反应体系为25μL，内含引物各 0.4mmol/L、Mg2+2mmol/L、dNTP 0.4mmol/L、Taq DNA聚合酶1U和模板2.5μL，94℃预变性5m in，然后进行35个循环(94℃变性30s，Tm-5℃退火 30s，72℃延伸 2min ～3.5min)，72℃下保温10min。6对候选引物分别按上述体系进行PCR反应，电泳检测，筛选出扩增特异性好、效率高、重复性好的引物。

表1 rt基因扩增引物Tab.1 Amp lification primers of rt gene

1.4 优化PCR条件，确定最佳退火温度和反应最佳循环数

以引物的理论退火温度为中心温度，间隔1℃，共8个梯度，进行梯度 PCR，电泳检测，同时使用

Image J 1.41软件(NIH)对电泳图进行灰度分析，确定出引物的最佳退火温度。配制一系列PCR反应液置于PCR仪中，预反应44个循环，反应进行到14个循环时取出一管，之后每隔2个循环取出一管，直至44个循环结束，电泳检测，确定出反应的最佳循环数。

1.5 确定单拷贝PCR扩增最适模板浓度

使用上述方法扩增RT-SHIV全长rt基因，梯度稀释质粒模板，直至扩增阳性率小于30%，按照泊松分布，此时扩增产物为单拷贝序列［7］。

1.6 血浆中 RT-SHIV病毒全长 rt基因的单拷贝PCR扩增

从 RT-SHIV感染猴血浆样本中提取出病毒RNA，逆转录成cDNA为模板，使用本文建立的方法扩增RT-SHIV全长rt基因，然后进行有限地稀释，扩增单拷贝序列，电泳检测，诺赛公司序列测定，BioEdit软件序列分析。

2 结果

2.1 质粒拷贝数的计算

RT-SHIV质粒全长为13216bp，分光光度计测定质粒浓度为150ng/μL，按上述公式计算质粒浓度约为1×1010copies/μL，10倍系列稀释至1×102copies/μL，得到9个不同的模板浓度。

2.2 筛选rt基因特异性扩增引物

6对引物以高浓度(拷贝数为 1×106copies/μL)质粒作模板进行初筛，电泳检测，如图1所示，使用引物RT-out-F/R扩增时，所得产物特异性较差，在约400bp处存在明显的非特异性扩增，条带较弱扩增效率也不高，虽然阳性率高达100%，但各平行管间重复性较差，使用Image J软件灰度扫描后比对各平行管间差异较大，变异系数(CV%)为72.46远高于其他引物，不适合作为扩增 rt基因引物。

剩余5对引物低浓度(拷贝数为1×104copies/μL)质粒作模板继续筛选，电泳检测，结果如图2所示，只有引物TC-out-F1/R1和 RT-F/R扩增阳性率为100%，且没有出现非特异性扩增、扩增特异性好，平行管间亮度比较一致、重复性高，而其余引物扩增阳性率均未达到100%、条带亮度较弱、扩增效率不高，同时如引物TC-out-F2/R2结果所示，平行管间亮度差别较大、扩增重复性较差。使用Image J软件灰度扫描也得出一致的结果，如表2所示，扩增阳性率最高的为引物TC-out-F1/R1和 RT-F/R，均达到了100%；产物产量最高的是引物TC-out-F2/R2，但其标准差较大，平行管间重复性较差；变异系数最小的为引物TC-F2/R2，其次是 RT-F/R和TC-out-F1/R1，但是引物TC-F2/R2的扩增阳性率最低，仅为60%。故综合扩增特异性、阳性率、效率和重复性等条件考虑，选择引物TC-out-F1/R1和 RT-F/R作为特异性扩增rt基因的外套和内套引物。

图1 RT-out-F/R扩增产物注：1：阴性对照 2-7：RT-out-F/R扩增产物M：DL5000Fig.1 Amplification products of RT-out-F/RNote：1：Negative control；2-7：Amplification products ofRT-out-F/R；M：DL5000

表2 5对引物扩增比较结果Tab.2 Comparison of the amplification results of the five pairs of primers

2.3 最佳退火温度的确定

随着退火温度的改变，PCR扩增效率发生明显变化，效率最高处即定为最佳退火温度，引物TC-out-F1/R1和 RT-F/R的最佳退火温度范围分别为(46.4～48.6)℃和(49.4～50.4)℃，见图3，最终选择为48℃和50℃。

2.4 PCR反应最佳循环数的确定

选取PCR反应过程中第14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44个循环时分别检测产物扩增量，从图4A中可以看出，使用 TC-out-F1/R1引物扩增时，从20个循环开始出现目的条带，随着循环数的增加，亮度逐渐增加，当循环数至34个时，可以看到清晰的条带，随着循环数的增加，目的基因产量并没有明显增加，表明PCR反应已至平台期，使用TC-out-F1/R1引物扩增的最佳循环数为34个循环。同理，使用RT-F/R引物从36个循环开始反应进入平台期，最佳循环数为36个循环。使用Image J软件灰度扫描也得出一致的结果，如图4所示，引物TC-out-F1/R1和RT-F/R分别在第34和36个循环时，反应进入平台期，最终最适循环数分别为34和36个循环。

图2 5对引物扩增产物注：1，7，13，19，25：阴性对照；2-6：TC-out-F1/R1，2527 bp；8-12：TC-out-F2/R2，2383bp 13-18：TC-F1/R1，1986bp；20-24：TC-F2/R2，1945bp；25-30：RT-F/R，2186bp；M：DL5000Fig.2 Amplification products of the 5pairs of primersNote：1，7，13，19，25：Negative control；2-6：TC-out-F1/R1，2527 bp；8-12：TC-out-F2/R2，2383bp；13-18：TC-F1/R1，1986bp；20-24：TC-F2/R2，1945bp；25-30：RT-F/R，2186bp；M：DL5000

图3 梯度PCR结果 (A：TC-out-F1/R1，B：RT-F/R)Fig.3 Rsults of gradient PCR(A：TC-out-F1/R1，B：RT-F/R)

图4 不同循环数PCR结果(A：电泳结果；B：灰度分析结果)Fig.4 The results of PCR with different number of cycles(A：Results of electrophoresis.B：Gray value analysis)

2.5 确定单拷贝PCR扩增最适模板浓度

有限稀释的模板一轮 48℃退火，34个循环；二轮50℃退火，36个循环，电泳检测，如图5所示，模板浓度为1×103copies/μL时，扩增阳性率达80%，未达到单拷贝要求；当模板浓度为1×102copies/μL时，扩增阳性率为20%，符合单拷贝PCR要求。

2.6 单拷贝PCR扩增血浆中RT-SHIV病毒全长rt基因

使用本文建立的方法扩增载量约为300copies/mL的RT-SHIV感染猴血浆样本中全长 rt基因，电泳检测，如图6所示，该方法扩增所得产物特异性好、扩增效率高；将模板进行10倍稀释，扩增阳性率约为66%，20倍稀释后阳性率约为16%，进而估算出要想达到单拷贝PCR低于30%阳性率的要求，需进行约16倍稀释。将单拷贝PCR模板所需稀释度与病毒载量结果联系起来，使得所建立的方法更加方便准确。

图5 10倍稀释标准品电泳结果注：1，7：阴性对照；2-6：1×103 copies/μL；8-12：1×102 copies/μL；M：DL5000Fig.5 Results of electrophoresis obtained from 10-fold serial dilutions of standardNote：1，7：Negative control；2-6：1×103 copies/μL；8-12：1×102 copies/μL；M：DL5000

图6 RNA模板电泳结果注：M：DL5000；1-6：10倍稀释；7-12：20倍稀释Fig.6 Results of electrophoresis obtained from the RNA templateNote：M：DL5000；1-6：10-fold dilution；7-12：20-fold dilution

2.7 HIV－1rt基因序列分析

HIV-1rt基因全长1680bp，包括聚合酶区、连接区和RNase H区，测序结果显示，扩增产物含有全长的rt基因，未发生重组，病毒在体内复制过程中存在变异，本文初步分析了 RT-SHIV感染猴 d266和d294样本，结果显示，与原始序列相比，d266样本全长rt基因只发生了1处M403I氨基酸改变；而d294样本全长rt基因发生了6处氨基酸改变，分别是E29K、E42K、G196R、R311K、M403I、E514K。该方法能够准确地反应病毒序列的真实情况，为研究分析艾滋病猴模型中病毒遗传变异情况打下了良好的基础。

3 讨论

HIV-1的rt基因是抗病毒治疗的一个重要靶点，然而在体内复制过程中极易产生突变，尤其是多种耐药性突变的出现会导致抗病毒治疗的失败，通过扩增得到尽可能多的病毒序列，真实反映体内病毒遗传变异情况，研究体内病毒群体多样性和治疗过程中rt基因的序列变异情况，对于抗病毒药物的筛选以及新药的研发有着重要的意义。但是，目前尚未建立起完善的rt基因检测手段，阻碍了相关研究的进展。

本文建立了较成熟的RT-SHIV全长rt基因单拷贝PCR扩增方法，可对全长rt基因进行序列分析，两对引物TC-out-F1/R1和RT-F/R的最佳退火温度分别为48℃和50℃，反应的最佳循环数分别为34和36个循环。当模板浓度为100copies/μL时，扩增得到单拷贝序列，能够扩增出大量的全长rt基因，最大程度上反应了体内病毒序列的真实信息。同时，由于两对引物定位于RT-SHIV病毒的SIV骨架上，故可应用于各类 RT-SHIV和SIV病毒，具有广泛的应用范围。使用该方法从感染猴血浆中扩增RT-SHIV全长rt基因，特异性强，扩增效率高，血浆载量为300copies/mL的样本经16倍稀释后，所得产物为单拷贝序列。初步分析了RT-SHIV感染猴体内病毒的rt基因，能够监测到病毒在体内复制过程中氨基酸的变异情况。

传统的PCR方法得到的是混合型产物，来源于不同的病毒拷贝，测序分析时会遗漏掉许多重要的序列信息。而本文建立的方法通过有限地稀释模板，能够扩增出大量的单拷贝序列，最真实地反应出体内病毒的序列情况。

全长rt基因为1680bp，包括聚合酶区、连接区和RNase H区，由于聚合酶区是药物的最主要靶点，所以过去研究的重点就在于 rt基因的前 600bp，同时也建立起了单拷贝 PCR扩增方法［8］。但是，近年来又发现rt基因的其他区域发生突变也会改变病毒对药物的敏感性［9］，然而，目前尚没有建立起全长rt基因的单拷贝PCR扩增方法，阻碍了病毒体内遗传与变异的研究，本文建立的方法具有重大的应用价值。

建立RT-SHIV全长rt基因单拷贝PCR扩增方法的最终目的是应用于病毒遗传与变异的研究，一个方法建立需要大量的实验实践来评估和验证，而本文扩增的RT-SHIV感染猴血浆样本较少，只对该方法的初步应用进行了探讨，尚未对猴体内病毒遗传变异情况进行深入探讨，接下来的工作就是大量扩增RT-SHIV感染猴血浆样本，进一步验证所建立的单拷贝方法，同时深入探讨猴体内病毒遗传与变异情况。

该方法的建立有助于研究各类RT-SHIV模型中全长rt基因的序列信息和病毒的遗传变异情况，以及在抗病毒治疗压力下耐药突变的产生和进化机制，为抗病毒药物和疫苗的筛选和研发提供坚实的基础。

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