茶陵野生稻及其导入后代间的遗传差异RAPD分析

蒋斌元，张 齐，康 敏，王胜利，龚建华，洪亚辉

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.株洲市农业科学研究所，湖南 株洲 412000）

水稻是一种重要的粮食作物，是人类主要的粮食来源，提高水稻产量以及防治病虫害一直是科研工作者们努力的方向[1]。普通野生稻是栽培稻的近缘祖先，保有许多宝贵的基因资源，是水稻突破性育种与生产的重要基因源[2-4]。在茶陵已发掘的新石器时代大塘文化遗址中发现了已碳化的谷物堆，由此可见，茶陵地区谷物种植历史悠久，茶陵野生稻具有重要的研究价值。湖南农业大学细胞生物学研究室与株洲农业科学研究所合作，将茶陵野生稻的基因组DNA采用花粉管通道法[5]导入受体栽培稻R9810、RCP08-29，其中R9810这一系中获得的后代已培育到第4代，表型各异，表现出明显的耐寒能力并且具有对株洲当地稻瘟病菌小种的抗性。笔者以茶陵野生稻及其导入后代为研究对象，辅以受体材料为对照，采用RAPD方法[6-9]研究总基因组导入后在遗传上所造成的影响，旨在配合大田表型筛选，为后续有目的性地筛选试验材料提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为茶陵野生稻（W）、超级稻R9810（C）、 导入后代D4（1：ys09203；2：ys09004；3：ys090015；4：ys090026；5：ys090027c）

1.2 方法

1.2.1 总DNA的提取 将供试材料洗净剪碎分别置于研钵中，加入液氮研磨破碎细胞，使用CTAB法[10]提取DNA，电泳检测。

1.2.2 RAPD扩增 经过多次筛选确定使用引物（表1）与25 μL反应体系，PCR反应程序为94℃预变性 5 min；94℃变性 40 s，36℃复性 40 s，72℃延伸1 min，共计40个循环；最后72℃延伸7 min。引物浓度为10 μM。随机引物由华大基因合成，利用随机引物对各样品基因组DNA进行扩增，凝胶电泳检测扩增产物。

表1 RAPD随机引物序列

1.2.3 数据分析 对凝胶电泳图谱进行统计，使用统计类软件NTSYSpc 2.1，基于非加权组平均法（UPGMA）对所得结果进行聚类分析[11-13]。

2 结果与分析

2.1 水稻基因组DNA的提取

提取的水稻基因组DNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，显示条带清晰（图1）。这说明所提取的水稻基因组DNA大分子较为完整，杂质和DNA的降解均比较少，符合RAPD所需要的PCR模板要求。经蛋白核酸测定仪测量，所提取的基因组DNA的A260/A280值为2.10，基本符合DNA的纯度要求。

2.2 RAPD分析

用筛选出的18个RAPD随机引物对各样品基因组DNA进行扩增，图2为部分RAPD电泳图。

对显示的凝胶电泳图谱进行统计，使用1和0表示带的有和无（表2）。使用统计类软件NTSYSpc 2.1基于UPGMA算法对所得结果进行聚类分析，做出聚类图（图3）。基于该聚类图所显示的遗传关系，发现茶陵野生稻总DNA经花粉管通道法导入栽培稻后，其导入后代在遗传关系上表现各异，有仍然趋向于受体R9810的，如5号导入后代，也有随机插入DNA片段后在遗传距离上发生了改变的，如 1、2、3、4 号导入后代。

表2 随机引物RAPD图谱条带读取结果

3 讨 论

采用花粉管通道法将茶陵野生稻的总基因组DNA导入栽培稻后，在表型上获得了许多变异，笔者使用RAPD法在分子水平上对基因组导入所引起的变异进行了分析说明。研究结果表明，茶陵野生稻在进化上处于比较原始的位置，受体R9810与5号导入后代有着较近的亲缘关系，5号材料在遗传上并未出现很大的改变，而1、2、3、4号导入后代在遗传上则受到了较大的改变，这些变化可能是由于DNA片段的随机插入而引起，亦或者是仅限于所选引物进行扩增才会显示的结果。总而言之，RAPD法能在某种程度上显示出采用花粉管通道法将供体基因组DNA导入受体后所产生的后代在基因组水平的变化，能为后续选育试验提供一定的参考。与表现型相结合，通过对花粉管通道法导入总DNA后获得的大量后代进行归类研究，能提高分类的准确性。

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