固相微萃取－气相色谱－质谱法测定大头金蝇样本内氯氮平

李学博，莫耀南，周海梅，李 朴，马锦琦，万立华，王清山

（1.重庆医科大学法医学与生物医学信息研究室，重庆 400016；2.河南科技大学法医学院，河南 洛阳 471003；3.重庆市公安局物证鉴定中心，重庆 401147）

在法医学检案过程中常遇到严重腐败甚至白骨化的尸体，难以获得合适的用于毒物分析的体液和组织样本，此时嗜尸性昆虫的幼虫和蛹可以作为 可 靠 的 检材[1－2]。1980 年 Beyer等[3]首次利用孳生在骸骨上的蛆虫样本成功检测出了苯巴比妥药物，随后的研究表明多种药（毒）物可以通过昆虫样本进行检测，Kharbouche等[4]利用液相色谱－质谱联用（LC/MS）技术从丝光绿蝇体内成功测定了可待因，Wood等[5]利用液相色谱－串联质谱联用（LC－MS/MS）技术从红头丽蝇幼虫体内成功检测了10种苯二氮卓类药物，Gosselin等[6]利用高效液相色谱－串联质谱（UPLC－MS/MS）方法成功检测了丝光绿蝇幼虫体内的美沙酮，Roeterdink等[7]利用电感耦合等离子体质谱（ICP－MS）技术分析了丽蝇幼虫体内射击残留物成分，此外，也有利用气相色谱－质谱（GC/MS）技术成功定量检测蝇蛆体内苯丙胺类毒品及马拉硫磷的报道[8－10]，现代化检测仪器设备的使用使定量测定单个幼虫及蛹样本的药（毒）物水平成为可能[5－6]，甚至羽化后的空蛹壳和排泄物也可以检测到部分毒物成分[11－12]，即使在软组织中不能检测到的毒物，仍可以通过蝇类幼虫测得[13]。更为有利的是，以昆虫为检材进行药（毒）物分析时，分析仪器还不会受到尸体分解产物，如尸碱的影响[2，14－15]。

氯氮平（clozapine，CLP）是临床最常用的抗精神病药物之一，也是患者意外过量服用中毒死亡和自杀案件中常见的药物。本研究通过建立固相微萃取气相色谱－质谱联用（SPME－GCMS）的检测方法，对取食含有不同浓度CLP培养基质上的大头金蝇幼虫和蛹进行定量检测，旨在为同类中毒死亡案件的分析检验提供相关借鉴。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

6890－5973N气相色谱－质谱联用仪：美国Agilent科技有限公司产品；NIST98色谱工作站；固相微萃取仪（SPME）及100μm聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）萃取头：美国Supelco公司产品。

氯氮平（clozapine，CLP）标准品：中国药品生物制品检定中心提供；洛沙平（loxapine）标准品：内标，中国药品生物制品检定中心提供；氯化钠、氢氧化钠、甲醇：均为分析纯。

1.2 仪器条件及溶液配制

1.2.1 色谱－质谱条件 色谱柱：HP－5MS（30 m×0.25mm×0.25μm）弹性石英毛细管柱；柱流量1.0mL/min；柱温设定：初温160℃，以40℃/min升温至260℃，再以5℃/min升温至280℃；进样口温度：260℃；载气：高纯氦气；进样方式：不分流进样；GC/MS接口温度：280℃；EI源（70eV），电子倍增器电压1 106V。

1.2.2 溶液配制 精密称取CLP标准品5 mg，添加50mL甲醇溶解稀释，得100mg/L CLP标准品储备液，同法配制100mg/L洛沙平储备液，置于4℃冰箱避光保存。精密量取CLP标准品储备液，加甲醇分别配置成50、100、500、1 000、5 000、10 000、50 000μg/L浓度的标准工作液。同法配制1 500μg/L浓度的内标工作液。

1.3 大头金蝇培养

供试大头金蝇为野外捕获，经鉴定种属后在实验室内连续培养获得，在蝇笼内以红糖、奶粉饲养，产卵高峰期以新鲜猪肝诱其产卵。取肝组织4份，400g/份，分别添加2mg、4mg及8mg的CLP水溶液后搅碎混匀并盛装在500mL烧杯内，分别编号C1、C2、C3，同时设空白对照组C0组。将卵块取出后按照400粒/份分别接种至以上含有不同浓度CLP的培养基上，将烧杯放至30cm×40cm×30cm的培养盒内，培养盒底层铺有2cm消毒细沙，上口覆盖固定细孔纱网。置于实验温度（25±0.2）℃，相对湿度（75±5）%，光周期L∶D＝14∶10下培养。参照文献[4]方法，分别在大头金蝇卵孵化后的52、76、100、124h及离食前期和后期取幼虫各50只，待幼虫化蛹后，取蛹样本50只，将以上样本置于－20℃冰箱冻死，保存备检。

1.4 样本处理与测定

取不同时期的大头金蝇幼虫及蛹的样本，每次分析随机取10只，称重后按照参考文献中的方法[4，16]，先后用去离子水反复冲洗，去除体表粘附的食物组织，用滤纸吸干体表残留液体，在样本中加入200μL内标工作液，添加甲醇4g匀浆，置于60℃水浴中加热平衡10min，离心，取上清液2mL至4mL样品瓶，加入1.0g NaCl饱和溶液，添加1mol/L NaOH调节pH为9，振荡20s。再将样品瓶置于40℃水浴中加热平衡10min，然后将萃取头浸入样品萃取30min。取出萃取头置于双蒸水中振洗20s，然后置于50%甲醇中振洗10s，取出后挥干并插入GC/MS进样口解析90s。

1.5 统计分析

2 结果与讨论

2.1 色谱质谱图

取含有内标的CLP标准工作液，以扫描方式进样及选择离子（SIM）方式检测，其总子流图示于图1。待CLP与内标完全分离，二者的保留时间分别为6.97min及10.01min，CLP选择离子为：m/z 243、256、192、245，洛沙平选择离子为：m/z257、83、70、193，如图2、图3所示，未见其他干扰成分。

图1 GC/MS方式检测样本内的总离子色谱图Fig.1 TIC of samples analyzed by GC/MS

2.2 检测限与标准曲线

取孵化后100h的C0组大头金蝇幼虫10只/份，按照预处理方法洗净后分别添加一定量的CLP，制作分别含有 CLP 5、10、50、100、500、1 000、5 000μg/L的样品（均含内标500μg/L），以选择离子方式进样，测定CLP检测限并计算信噪比，根据峰面积比对浓度比（CLP对内标）作线性回归。结果显示CLP的检测限为0.1 μg/L（信噪比＞3），在5～5 000ng/mg范围内线性良好，回归方程为：y＝0.039 9x－0.607 3，r＝0.999 8（n＝7），示于图4。

图2 氯氮平的总离子质谱图Fig.2 Toltal ion mass－spectrograms of CLP

图3 洛沙平的总离子质谱图Fig.3 Toltal ion mass－spectrograms of loxapine

图4 氯氮平的标准工作曲线Fig.4 Standard curve of CLP

2.3 回收率与精密度

取孵化后100h的C0组大头金蝇幼虫10只/份，按照预处理方法洗净后分别添加一定量的CLP，分别制作含有CLP 100、500、1 000μg/L样品（均含内标500μg/L），按1.4样品预处理步骤操作后分析测定，1日内重复分析测定5次，连续测定3日，按照上述回归方程计算各浓度的相对回收率均值，并得日内及日间精密度均值，列于表1。

2.4 大头金蝇样品内CLP水平测定

按上述样品处理方法及检测条件，对生长在含有不同浓度CLP培养基质上的大头金蝇不同时期的幼虫和蛹进行分析测定，成功定量检测出了样品中的CLP。实验用于检测的样本经去离子水和甲醇反复冲洗后，可去除体表食物成分中CLP对检测的影响[17]，使结果更加准确。

表1 SPME－GC/MS法在大头金蝇幼虫样本内的准确度及精密度Table 1 Accuracy and precision of clozapine from larvae of Chrysomya megacephala by SPME－GC/MS

检测结果列于表2。由表2可看出，在取食期、离食期的幼虫和蛹内均检测到了CLP，其中76h、100h及124h的取食期幼虫各实验组样本间CLP水平差异显著（P＜0.05）。大头金蝇样本内CLP水平与取食时间有关，在幼虫发育的早期CLP水平较低，随着取食时间的延长而增长，与上一次检测结果相比，取食76h和124 h的幼虫变化显著（P＜0.01），这可能与CLP在幼虫体内不断蓄积有关。在离食期CLP水平又大大降低（P＜0.01），这是由于此时CLP的排泄大于摄入所致，蛹期仅检测到极微量的CLP，与相关研究报道一致[12，18]。通常情况下，由于受到代谢的影响，组织中的药物浓度明显高于昆虫样本[19]。

表2 不同时期的大头金蝇幼虫及蛹样本CLP的浓度（μg/g，±s）Table 2 Concentration of CLP in samples of larvae and pupae in different time（μg/g，±s）

表2 不同时期的大头金蝇幼虫及蛹样本CLP的浓度（μg/g，±s）Table 2 Concentration of CLP in samples of larvae and pupae in different time（μg/g，±s）

分组 幼虫52h 幼虫76h 幼虫100h 幼虫124h 离食前期幼虫 离食后期幼虫 蛹C1 1.9±0.33 2.38±0.81 3.23±1.22 4.27±1.23 2.02±0.67 1.24±0.37 0.09±0.02 C2 2.33±0.38 4.12±1.56 6.22±1.55 8.25±3.58 3.84±1.26 1.65±0.43 0.15±0.06 C3 3.28±0.65 6.56±2.34 9.61±2.67 12.33±4.224.55±1.85 1.88±0.76 0.18±0.05

3 结 论

SPME技术是一种新型的样品前处理技术，它利用待测物对活性固体表面的吸附力而达到分离富集的目的，因萃取不破坏样品本身的性质，而又具有简单、快速、环保、灵敏度和精密度高的优点，SPME－GC/MS联用的方法已被广泛应用于包括体液、组织等多种生物样品中化学成分的检测。本研究应用SPME－GC/MS联用的方法，准确定性、定量检测大头金蝇不同时期的幼虫及蛹样本的CLP浓度，检出限为0.1μg/L，在5～5 000μg/L范围内线性良好，不同浓度的回收率在93%～104%间，日内及日间RSD均小于8%。

该方法结果可靠，简便快捷，精密度好，可用于此类中毒案件的法医学分析测定，昆虫样本可作为替代或补充样本，与腐败组织及体液相比，昆虫体内的药（毒）物保存时间更稳定持久[20－21]，在难以获得合适的组织体液样本及尸体严重腐败，影响仪器检测效果的案件中有重要价值。另一方面，对疑为谋杀后伪装CLP中毒，有蝇蛆孳生的案件，可检测尸体特殊部位昆虫样本获得间接证据，为案件分析提供参考依据。本研究显示，大头金蝇样本内CLP水平与食物内的含量具有相关性，不同阶段大头金蝇样本CLP含量随时间的变化而改变，取食阶段的幼虫体内含量可不断蓄积到较高水平，到达离食期后由于幼虫停止取食加上正常的排泄导致体内CLP水平急剧下降。部分研究[4，12，22]也表明，药（毒）物在昆虫体内存在明显的蓄积及分解代谢活动，可引起体内药物水平及成分的明显改变，因此今后的研究还要加强代谢物的检测，以获得更为精确的结果。

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