十字花科蔬菜根肿病研究新进展

李金萍 柴阿丽 孙日飞 李宝聚

（中国农业科学院菜蔬花卉研究所，北京 100081）

根肿病是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicaeWoron.）引起的十字花科蔬菜病害。1878年由俄国学者Worolin 发现其病原，并命名，所有十字花科蔬菜的感病品种都会被这一病原菌侵染，该病最早是在13 世纪发现于地中海西岸和欧洲南部。目前，在欧洲、北美和亚洲的日本等地已成为一种主要病害，给十字花科蔬菜生产造成了严重的威胁，在加拿大等十字花科蔬菜栽培大国，也已成为一种新流行的病害（Hwang et al.，2012），现全世界均有分布，尤以温带地区发生更为严重。根肿病在中国大部分省、市、自治区都有分布，特别是近年来，根肿病在我国的东北地区、西南地区、长江中上游地区以及山东青岛等地迅速扩大，危害十分严重，制约着我国十字花科蔬菜产业的发展。根肿病一直是国内外学者研究的热点，经过几十年的不懈努力，在根肿菌分类地位、根肿菌生理小种分化、病原菌检测技术、病原菌有效接种技术、病原菌生活史与生物学特性、根肿病防治等方面已取得突破性进展。近几年来，根肿病的研究在病原菌检测、病原菌生物防治技术、病原菌生活史等方面取得了比较突出的成绩。

1 根肿病研究新进展

1.1 病原菌分类地位

芸薹根肿菌（P.brassicae）属根肿菌目根肿菌纲根肿菌属。对于根肿菌目的分类地位，目前尚有争议。Hawksworth 等（1995）将其归为真菌界粘菌门根肿菌纲，Alexopoulos 和Mims（1979）则将其划到真菌界鞭毛菌亚门根肿菌纲。目前研究中根据其形态学特征及分子生物学研究将芸薹根肿菌划分到原生界根肿菌门根肿菌纲根肿菌属（Neuhauser et al.，2011）。

1.2 病原菌生活史与发生规律

芸薹根肿菌是严格的专性寄生菌，其生活史有两个阶段：初侵染阶段（根毛侵染），病原菌被限定在感染植物的根毛中；再侵染阶段（皮层侵染），病原菌在根和下胚轴的皮层和中柱中繁殖（Hwang et al.，2012）。土壤中休眠孢子变成初级游动孢子到达根毛表面后，穿过细胞壁侵入根毛内部，这个阶段被称为初侵染阶段；病原菌在根毛内部形成次生原生质团，一部分细胞核裂解形成多核的游动孢子囊，每个游动孢子囊产生4～16 个次游动孢子，侵入主根皮层，这个过程叫做再侵染阶段。病原菌在侵入的根部细胞内部形成次级原生质团与细胞分化有关，产生根肿组织（Feng et al.，2012）。

温度是影响根肿菌初侵染阶段的关键因子。温度为25 ℃时最利于根肿菌的初侵染，10 d就可以观察到发病症状，在20～30 ℃时14 d 才可以观察到发病症状，而当温度为10 ℃时28 d仍观察不到发病症状，低温不利于根肿病的发生（Sharmaa et al.，2011）。温度高于26 ℃时，同样不利于病原菌的侵染并完成生活史及快速繁殖，阻碍病害的发展（Gossen et al.，2011）。

1.3 病原菌分子生物学致病机理

明确根肿菌的分子生物学致病机理，可以为培育新的抗性品种以及其他防治手段提供有力参考。根肿菌是严格的专性寄生菌，不能进行纯培养，从分子生物学角度研究其致病机理存在很大困难。到目前为止，在根肿菌侵染寄主植物组织过程中基因表达的分子生物学特征方面的报道很少。国外进行了很多该方面研究，共涉及到100 多个部分cDNA 片段或者是全长片段，但经序列比对后同源性都比较低，均没有取得突破性的进展。Feng 等（2010）研究发现在根肿菌中存在少部分几个基因与其致病性有关，这些基因能够编码一个丝氨酸蛋白酶（PRO1），该蛋白酶能够刺激根肿菌休眠孢子萌发。PRO1 是一个单拷贝的基因编码的蛋白酶，广泛存在于根肿菌的致病型中。

1.4 病原菌诊断与检测技术

目前，以聚合酶链式反应（PCR）为基础的十字花科蔬菜根肿病检测技术迅速发展，由普通PCR 及巢式PCR 的定性检测发展到了荧光定量PCR 的定量检测，并且将定量检测与全细胞脂肪酸技术相结合，利用根肿菌侵染后产生的特异性脂肪酸（花生四烯酸20∶4）可以对土壤及植物组织中的根肿菌进行精确的定量检测（Sundelin et al.，2010）。同时，也可以应用荧光定量PCR 检测技术对粘附带菌交叉污染的种子、块茎等进行定量检测，对其带菌量进行风险评估（Rennie et al.，2011）。采用Tapman 探针与荧光定量PCR 技术相结合对田间发病的土壤及人工接种的带菌土壤进行检测，该体系的扩增效率在92%以上，其检测的最低限点可以达到每克土壤500 个休眠孢子，利用人工接种与定量检测相结合的方法，可以根据土壤的带菌量对田块的病情进行准确的预测，为种植抗病品种及轮作等防治手段提供理论依据（Wallenhammar et al.，2012）。因此，以聚合酶链式反应为基础的分子生物诊断及检测技术已成为根肿菌研究及根肿病防治方面的有力工具，只是在不同的研究中要不断地调整引物的特异性以及反应程序。

1.5 根肿病生物防治

十字花科蔬菜根肿病防治采取的主要手段有选育抗病品种、化学防治、土壤消毒、轮作以及生物防治等，但是一直缺乏有效的化学药剂，对于田间大面积发生根肿病的土壤进行消毒也是不切实际的做法。目前，有商品化的抗性品种，但是这些抗性品种的持久性未知，并且根肿菌存在明显的生理分化，抗性品种也具有很强的小种专化性，当生理小种发生变异时，品种将丧失抗性。目前，有一些生防效果较好的生防物质及生防菌存在，生防菌主要有茎点霉属真菌Phoma glomerata、枝顶孢属真菌Acremonium alternatum以及大白菜根部的一种内生真菌Heteroconium chaetospira（Grove）M.B.Ellis，一种酚类物质—龙胆酸对根肿病也有一定的防效。由于十字花科蔬菜根肿病病原菌具有很强的抗逆性，在土壤中存活时间长，因此，采用土壤中的生防菌对其进行防治成为目前研究的热点，并且也为根肿病的防治提供了新的思路。研究发现枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisQST713）对根肿病有很好的防效，可以达到60%以上（Lahlali et al.，2011）。同时，在我国从大白菜根际周围土壤中分离得到 1 株链霉菌中的灰红链霉菌（Streptomyces griseorube）可以有效的控制根肿病，在温室条件下防效可以达到72.8%，在大田条件下防效可以达到68.5%（Wang et al.，2012）。粘帚霉在防治根肿病方面也有很好的效果（Peng et al.，2011），并且枯草芽孢杆菌以及粘帚霉等生防菌已经有商品化产品存在，为根肿病的田间控制提供了新的锲机。

2 展望

2.1 我国根肿菌生活史研究趋势及展望

从根肿菌生活史的研究历程来看，国外研究起步较早，在明确根肿菌生活史的基础上，部分实验室甚至通过双重培养技术以及悬浮细胞培养技术可以观察到整个根肿菌在根部侵染的过程以及整个生活史的完成过程。我国在根肿菌生活史研究方面尚处于起步阶段，还没有系统的报道。我国幅员广阔，气候条件差异大，根肿菌的生活史是否与国外一致尚不清楚。生活史不明的同时也阻碍了致病机理方面的研究进程。因此，可以先考虑研究清楚我国分布的根肿菌生活史，在此基础上对各个阶段机理及肿根的形成过程中植物机体的代谢途径、信号传导以及次生物质的产生等进行细化研究，为十字花科蔬菜根肿病从生活史方面入手进行防治提供帮助。

2.2 根肿菌致病机理深入研究的必要性

近年来，根肿病菌分子检测技术发展很快，利用分子水平对根肿菌的致病机理进行研究已成为一种趋势，国外的学者及科研人员在这方面做了很多工作，但只有Feng 等（2010）在这方面取得了一定的成果，在根肿菌中发现存在单拷贝的基因可以编码1 个丝氨酸蛋白酶，该蛋白酶能够刺激根肿菌休眠孢子的萌发。至于具体刺激根肿菌休眠孢子萌发的原因、机理尚不清楚。在生物化学以及植物病理学方面的研究还没有明确根肿菌的致病机理，只是推测根肿菌侵染过程中肿根的形成是由于根肿菌侵染植物组织后刺激植物组织产生细胞生长激素以及细胞分裂素，但具体机理不清楚。致病机理是制定防治策略的依托，根肿菌致病机理的深入研究及细化对于根肿病控制将是必不可少的。

2.3 病原菌离体培养技术是未来发展的一大趋势

由于根肿菌是寄生于十字花科蔬菜根内的专性寄生菌，很难直接得到纯培养的单孢菌系，只能从根肿组织通过机械粉碎过滤离心后获得根肿菌休眠孢子。采用单孢接种技术对根肿菌与根毛组织进行离体双重培养以及细胞悬浮培养技术可以对根肿菌进行离体培养，但不能获得大量的肿根，直接影响了十字花科蔬菜根肿病的研究进程（Kageyama & Asano，2009）。在根肿菌的研究过程中接种物不断地活体培养与繁殖，费时、费力，浪费大量的温室资源，并且根肿菌是土传病害，在接种物的培养基繁殖过程中很容易造成病害的传播及大面积蔓延。

同时，根肿菌存在明显的生理分化，生理小种鉴定是十字花科蔬菜根肿病抗病育种的基础，而直接得到纯培养的单孢菌系又是生理小种准确划分的基石，虽然在根肿菌生理小种鉴定时可以采用单孢接种技术，但单孢接种发病率低，需要多代培养观察，费时、费力。根肿菌纯培养技术将是未来发展的一大趋势，如何科学地对根肿菌进行离体培养是当前迫切需要解决的关键问题，建立实用科学的根肿菌离体培养方法，仍然是国内植物病理学研究的重要问题，只有这样才能提高十字花科根肿菌致病机理、生理小种鉴定以及作物抗病品种选育效率，最终实现对根肿病的持续控制。

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