分别应用基因芯片和solexa技术研究脐血干细胞体外诱导的巨核细胞基因表达谱

王 芳 何 吉 朱发明 刘晋辉 秦 斐 陈 舒 徐 罡 吕杭军 严力行

人体血液中的血小板在出凝血功能中具有重要的作用，血小板数量降低的病人容易发生大量出血，特别是接受高剂量化疗和造血干细胞移植的病人，体内长时期血小板减少的治疗一直是临床关注的焦点。巨核细胞由造血干细胞分化而成，其产生血小板是一个十分复杂的过程，到目前为止其分子机制仍不明确。本实验采用人脐血干细胞体外TPO诱导扩增分化为巨核细胞，分别应用基因芯片技术和solexa测序技术检测MKs、非MKs的基因和mRNA表达差异，探讨巨核细胞的表达机制、信号传导及调控机制，为造血干细胞分化为巨核细胞用于临床输注打下基础。

材料与方法

1.材料:脐带血由浙江大学附属妇产科医院提供。IMEM培养基、RPMI1640购自美国 Gibco公司;血小板生成素(TPO)、无血清培养基(Stem SpanTMSFEM)购自加拿大Stem Cell公司;鼠抗人CD41a一抗购自捷克Exbio公司;CD34细胞MACS磁珠分选试剂盒购自德国美天尼公司;羊抗鼠IgG免疫磁珠购自美国DYNAL公司;光学显微镜购自Nikon公司;TRIzol Reagent购自美国 Invitrogen公司，RNA纯化(QIAamp RNA Blood Mini Kit)购自德国QIAGEN公司;RNA抽提试剂盒(QIAamp RNA Blood Mini Kit)购自德国Qiagen公司;RTPCR试剂盒(SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis System)购自美国Invitrogen公司;引物自行设计，由上海申能博彩公司合成;基因芯片制作及软件分析由上海生物芯片有限公司提供;solexa测序及软件分析由杭州华大基因研发中心提供。

2.方法:(1)HSCs的体外分离、纯化、扩增培养和诱导分化:脐带血标本与生理盐水以1∶1充分混匀，加到比重为1.077g/ml的淋巴细胞分离液上，收集中间的单个核细胞层，MACS磁珠分选 CD34+造血干细胞。将富集的细胞用含100ng/m l TPO无血清培养基混匀后，1×105/ml接种到培养瓶中，置于37℃、5%饱和CO2湿度培养箱中培养12天，第7天半量换液。(2)巨核细胞的分离:将培养的细胞加入鼠抗人CD41a抗体(1μg/L×106细胞)，2～8℃孵育10min，Buffer (pH7.4)洗涤。加入羊抗鼠免疫磁珠(25μl/L×107细胞)孵育，将试管放置于磁铁中2min，收集上清中的非巨核细胞(非MKs)，取去磁铁，用Buffer重悬细胞。(3)总RNA提取:采用QIAamp RNA Blood Mini Kit，按照试剂盒内说明书操作。(4)基因芯片制备:将分选的MKs、非MKs细胞加入TRIzol试剂(1毫升/5×106细胞)，使之充分溶解于TRIzol中形成清亮不黏稠的液体。-80℃冰箱中保存。将TRIzol试剂处理后的细胞用干冰送至上海生物芯片有限公司检测、分析。芯片型号Affymetrix U133plus2.0。本研究选用2张芯片对MKs和非MKs细胞cDNA样本作平行分析。(5)Solexa测序:将抽提好的MKs、非MKs RNA用干冰送至华大基因研发中心进行表达谱样品制备、solexa测序、信息分析。

结果

1.CD34+细胞纯度、CD41+细胞纯度、总RNA提取结果:经流式细胞仪检测CD34+细胞平均纯度达90%，显微镜下观察CD41+细胞纯度达85%(图1)。分别提取MKs、非MKs细胞的总RNA，在进行表达谱基因芯片和solexa测序实验前进行总RNA的质量检验，结果符合要求。

2.基因芯片杂交数据分析结果:基因芯片结果采用Affymetrix扫描仪进行扫描，GCOS1.4软件读取、处理数据。差异基因筛选标准是:以|log ratio|≥1作为判断基因表达差异的阈值，log ratio≥1为上调基因;log ratio≤-1，为下调基因。从38000多个基因表达谱中筛选MK和非MK细胞的差异基因1834个，上调基因为711个，下调基因为1123个。

图1 分选后CD61+细胞

3.Solexa数据分析结果:solexa技术检测MK和非MK细胞表达谱的基本情况，其中获取的Tag初始数量MK和非MK细胞分别为3773147和3533805个。整个清晰的Tag数量分别为3291132和2967947个，明显独特的Tag数量分别为197769和245318个，未知的Tag数量分别为4496和4204个，分别占清晰Tag的2.27%和1.71%。差异基因筛选标准是:以FDR≤0.001，|log2Ratio|≥1作为判断基因表达差异显著的阈值，log2ratio≥1为上调基因; log2ratio≤ -1，为下调基因。差异表达基因数为2063个，上调基因表达数量为1161个，下调为902个。差异表达Tag数为Tag4236个，上调Tag数量为2717个，下调为1519个。

4.基因芯片检测结果与solexa测序技术检测结果比较分析:基因芯片与solexa测序技术检测的MK与非MK差异表达基因中有507个是相同的，其中144个为上调基因，363个为下调基因。

讨论

人体血液中的血小板在出凝血功能中具有重要的作用，通过体外输注献血者的血小板可有效地提高病人体内的血小板数量，然而这种治疗手段需要反复输注血小板。近年来发现造血干细胞体外扩增的巨核细胞输注到病人体内后，能加速病人血小板的恢复，缩短血小板缺乏期，这将为化疗或移植后的血小板减少症提供一个潜在的新的治疗途径。

巨核细胞生成血小板是一个复杂的细胞增殖和分化过程，目前该过程的信号传导、调控机制尚不清楚。近年来人们一直在探讨其可能的分子机制。本实验采用人脐带血干细胞体外TPO诱导生成巨核细胞，经过免疫磁珠法分选，得到巨核细胞，纯度可达85%以上。本实验分别采用基因芯片技术和solexa测序技术对扩增后的MKs、非MKs基因表达谱进行研究，探讨其基因表达机制。

表达谱基因芯片是用于基因组功能研究的一种应用型芯片，在功能基因组学研究中发挥广泛的作用［1，2］，是集分子生物学、细胞遗传学、生物化学等多种高新技术为一体的研究手段。基因芯片技术经过近15年的发展已经形成了一个系统的平台，从样品制备、芯片制作、芯片杂交、数据扫描到后期的数据管理、储存以及深度数据挖掘都有了标准化的流程，成为一个非常稳定可信的实验技术，同时也积累了庞大的公共数据库。芯片杂交结果直观，分析快速，适合对大量生物学样品进行已知信息的检测，同时芯片数据分析有成熟完整的系统，为后期数据分析提供强大的支持。

Solexa表达谱分析技术是基于新一代高通量测序技术的全基因组表达谱分析方法，高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，可以帮助研究者跨过文库构建这一实验步骤，避免了亚克隆过程中引入的偏差，依靠后期强大的生物信息学分析能力，对照参比基因组完成基因组测序［3～6］。

基因芯片的缺点在于只能检测人们已知序列的特征。而高通量测序的强项就在于可以直接对任何物种进行包括未知基因在内的全基因组表达谱分析，其发现能力和寻找新的信息的能力从本质上高于芯片技术。作为两个高通量的基因组学研究技术，在应用的某些方面存在重叠和竞争，但是在更多方面是优势互补，两种方法联合使用，将解决以前的单种技术难以解决的问题。如 Euskirchen等［7］同时用ChIP-chip和ChIP-seq对STAT1的结合位点进行了检测，两种技术的检测结果具有非常好的相关性，而对于一些结合位点，Ch IP-chip和ChIP-seq都会丢失部分信息，而一种方法丢失的信息又恰好能被另一种方法所检出，完整的数据是来自两部分的整合。Oudes等应用基因芯片和高通量测序技术对前列腺癌细胞的基因表达谱的研究结果也发现同样的情况。

本实验我们同时应用基因芯片和solexa技术对脐血造血干细胞体外诱导分化的巨核细胞基因表达谱进行研究，结果显示，基因芯片技术从38000多个基因表达谱中筛选MK和非MK细胞的差异基因，上调基因为807个，下调基因为1326个。Solexa技术检测MK和非MK细胞表达谱，获取的Tag初始数量MK和非MK细胞分别为3773147和3533805个。整个清晰的Tag数量分别为3291132和2967947个，明显独特的Tag数量分别为197769和245318个，其中基因表达数量上调为1661个，下调数量为902个。Tag表达量上调为2717个，下调为1519个。从实验结果来看，solexa技术检测的基因数和Tag数量明显高于基因芯片技术。对于差异表达基因，基因芯片和solexa技术的检测到相同的基因507个，基因芯片检测到1327个独特的基因，solexa测序技术检测到1556个独特基因。这表明一种技术能弥补另一种技术遗漏的部分，因此需要不同实验技术的协同配合。应用两种方法共同检测到的MK和非MK差异表达基因功能与细胞内信号转导、转录调节、新陈代谢、细胞发育、运动、细胞凋亡和细胞黏连等功能有关，在维持细胞结构、细胞内运动、细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用。而两种方法各自检出的差异基因同样涉及这些功能，表明MKs和非MKs细胞基因表达存在显著差异，同时solexa表达谱结果显示约有2%的tag属于未知的序列，提示solexa表达谱分析技术更易发现新的转录组。

通过用基因芯片和solexs技术对MKs和非MKs基因表达谱的研究，可以发现大量有差异表达的基因，以及solexa测序发现的潜在调控基因和未知序列，有利于推动对人脐血干细胞体外扩增的巨核细胞基因表达分子机制研究，从基因表达模式上更好地了解各个基因的功能，更有效地进行基因功能分类，从而寻找最佳的细胞因子、转录因子，使巨核细胞在体外得以高效扩增用于临床诊断和治疗。

研究者可以充分享受基因芯片和solexs技术这两个平台，在利用solexs技术获取新信息的基础上，利用芯片的强项，即对已知信息的高通量、相对低成本的检测能力，对大量样品进行快速检测，短时间内获得有大量有效的数据。

1 Kim JA，Jung YJ，Seoh JY，et al.Gene expression profile of megakaryocytes from human cord blood CD34+cells ex vivo expanded by thrombopoietin［J］.Stem cell，2002，20(5):402-416

2 Kim HL.Comparison of oligonucleotide-microarray and serial analysis of gene expression (SAGE)in transcript profiling analysis of megakaryocytes derived from CD34+cells［J］.Experimental and molecularmedicine，2003，35(5):460-466

3 Aury JM，Cruaud C，Barbe V，et al.High quality draft sequences for prokaryotic genomes using a mix of new sequencing technologies［J］.BMCGenomics，2008，9:603-613

4 Bau S，Schracke N，Kränzle M，et al.Targeted next-generation se-quencing by specific capture ofmultiple genomic loci using low-volumemicrofluidic DNA arrays［J］.Anal Bioanal Chem，2009，393(1): 171-175

5 Trick M，Long Y，Meng J，et al.Single nucleotide polymorphism (SNP)discovery in the polyploid Brassica napus using Solexa transcriptome sequencing［J］.Plant Biotechnol J，2009，7(4):334-346

6 Hanriot L，Keime C，Gay N，et al.A combination of LongSAGE with Solexa sequencing iswell suited to explore the depth and the complexity of transcriptome［J］.BMCGenomics，2008，9:418-426

7 Euskirchen GM，Rozowsky JS，Wei CL，et al.Mapping of transcription factor binding regions in mammalian cells by ChIP:comparison of array-and sequencing-based technologies［J］.Genome Res，2007，17:898-909