盐酸苯达莫司汀的电喷雾串联质谱分析

刘珍仁，叶晓岚，2，范国荣＊，张大志，黄景华

［1.第二军医大学药学院药物分析学教研室，上海市药物（中药）代谢产物研究重点实验室，上海200433；2.广东药学院药物分析学教研室，广州510006；3.第二军医大学药学院有机化学教研室，上海200433；4.广东八加一医药有限公司，广州510515］

盐酸苯达莫司汀（bendamustine hydrochlo－ride，BDH），化学名：4－｛5′－［双－（2′′－氯乙基）氨基］－1′－甲基－2′－苯并咪唑基｝－丁酸盐酸盐，最早于19世纪60年代初由Ozegowski及其同事在德国耶拿的微生物试验协会研制成功。他们使一种烷基化氮芥（一种非功能烷化剂）连接一个嘌呤和氨基酸，变成一种双功能基烷化剂，通过烷化作用使DNA单链和双链交联，干扰DNA的功能和合成，从而发挥抗肿瘤作用［1］，其化学结构示意图见图1。

图1 盐酸苯达莫司汀的化学结构Figure 1 Chemical structure of bendamustine hydrochloride

BDH作为新一代抗癌药物，对多种癌症具有明显的治疗作用，可用于治疗霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病和乳腺癌等多种恶性肿瘤。美国FDA于2008－03－21批准Cephalon公司开发的BDH用于慢性淋巴细胞性白血病的治疗，商品名为Treanda。2008－10－31该药又获准用于惰性B细胞非霍奇金淋巴瘤的治疗［2］。2010年，Mundipharma公司宣布，欧洲医药管理局（EMEA）推荐在德国及欧盟其他成员国，如奥地利、比利时、丹麦等批准BDH用于治疗惰性非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病及多发性骨髓瘤［3］。目前，BDH尚未在中国大陆申请专利，也没有制药企业进行生产和销售，因此本品开发的潜力巨大。

目前大部分文献主要涉及BDH的药理、临床药效以及体内外代谢的研究［4－7］，但对于其质谱裂解规律尚未见报道。为了研究BDH的结构特征及其裂解途径，本研究采用电喷雾串联质谱（ESI－MSn）技术对BDH质谱裂解途径进行分析，找出主要的特征碎片离子及其质谱电离裂解规律，为BDH的结构修饰及其代谢产物的结构判断提供依据。

1 仪器和试剂

1.1 仪器 LCQ fleet质谱仪、ESI离子源、离子阱质量分析器和XcaliburTM2.0.7SP1数据处理软件（美国Thermo Fisher公司），XW－80A涡旋混合器（上海精科实验有限公司），XS205电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 试药 BDH原料药（批号：20110523，纯度99.87%，由第二军医大学药学院有机化学教研室提供）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；超纯水由第二军医大学药学院药物分析学教研室自制。

2 方法和结果

2.1 质谱条件

2.1.1 正离子模式 电喷雾电压4.5kV；鞘气流速241.15kPa；辅助气流速2.4L／min；毛细管温度350℃；毛细管电压35V；透镜电压95V；碰撞诱导解离能量35V。

2.1.2 负离子模式 电喷雾电压－4.5kV；鞘气流速241.15kPa；辅助气流速－2.4L／min；毛细管温度350℃；毛细管电压－35V；透镜电压－95V；碰撞诱导解离能量35V。

2.2 样品溶液的配制 精密称量BDH原料药10mg，置于10ml棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得对照品储备液。精密量取该储备液适量，用甲醇逐级稀释至1.0μg／ml的样品溶液，备用。

2.3 BDH在正离子模式下的质谱解析 将1.0μg／ml的BDH甲醇溶液直接注入质谱仪，质谱检测器调为正离子模式，获得其一级全扫描质谱图。从中可以观察到分子离子峰［M＋H］＋m／z 358。同时在一级质谱图中可以看到较强的离子峰m／z 360和m／z362，这是由于BDH结构中有2个Cl，而同位素37Cl的丰度比很大。根据同位素丰度比公式，即二项式（a＋b）n（a与b为轻质35Cl及重质同位素37Cl的丰度比，n为Cl原子数目），BDH一级质谱图中会出现M、M＋2及M＋4峰，且丰度比为9∶6∶1，与质谱图中的结果吻合，即［M＋H＋2］＋m／z360、［M＋H＋4］＋m／z362分别是含1个和2个同位素37Cl的分子离子峰。

在二级全扫描质谱图中，可以观察到m／z 340为最强离子峰，结合系统自带的质谱解析软件，此离子峰为准分子离子［M＋H］＋m／z358失去一分子H2O生成的产物离子［M＋H－18］＋。三级全扫描质谱显示有3个主要离子峰m／z 304、m／z 276和m／z228。离子峰m／z 304是二级离子碎片m／z 340失去一分子HCl而生成的产物离子；m／z 276是二级碎片离子m／z340先失去一分子CO后再失去一分子HCl而得到的离子碎片；m／z 228为离子碎片m／z 358断裂一分子CH2CH2Cl和一分子CH2Cl得到m／z 246的离子碎片，m／z 246再失去一分子H2O后得到m／z 228碎片离子峰。在四级全扫描质谱图中，主要有m／z 240、m／z 268和m／z 276 3个碎片离子峰，均是三级离子碎片m／z 304分别失去一分子CH2CH2Cl、HCl和CH2＝CH2生成的产物离子。从图中可以发现三级和四级质谱棒图中均有m／z276离子碎片峰，说明该离子碎片既可以由m／z 340裂解产生，也可以从m／z 304离子碎片裂解生成。其中正离子模式下质谱裂解棒图见图2，化合物裂解碎片结构见图3，裂解碎片结构树见图4。

图2 盐酸苯达莫司汀正离子模式下的多级质谱图Figure 2 MS／MSn photograms of bendamustine hydrochloride in positive ion mode

图3 盐酸苯达莫司汀正离子模式下的裂解途径Figure 3 Fragmentation pathways of bendamustine hydrochloride in positive ion mode

图4 m／z 358的分子离子在正离子模式下的碎片裂解结构树Figure 4 Fragmentation crack tree of molecular ion m／z 358in positive ion mode

2.4 BDH在负离子模式下的质谱解析 将1.0μg／ml的BDH甲醇溶液直接注入质谱仪，质谱检测器调为负离子模式，获得其一级全扫描质谱图（见图5）。从中可以观察到分子离子峰［M－H］－m／z 356，还可以看到同位素37Cl的分子离子峰［M－H＋2］－m／z358和［M－H＋4］－m／z360。二级选择m／z356作为母离子进行轰击，质谱图上基本无响应。

图5 盐酸苯达莫司汀负离子模式下的一级质谱图Figure 5MS photogram of bendamustine hydrochloride in negative ion mode

3 讨 论

利用ESI－MSn，根据软电离模式下能产生多级离子碎片的特点，可以推测BDH的裂解方式和碎片离子结构。BDH结构中的羟基、羰基以及氯乙基等位置容易发生断裂，产生一系列碎片离子。BDH在体内经水解后的代谢产物主要是羟基取代氯原子［8］，这与BDH在质谱中容易发生裂解的位置很相似，因此BDH的质谱裂解规律对其在体内的代谢产物结构判定有一定的提示作用。

由于BDH结构中有一个羧基，在正离子模式下，羧基易以CO和H2O的形式丢失；5′位C上的N直接相连的两个氯乙基中的氯原子也容易以HCl的形式脱去；同时氯乙基也可以通过断裂与氯原子相邻的亚甲基的方式进行裂解，或者氯乙基直接断裂，说明这几个位置都容易发生裂解产生新的离子碎片。而其中苯并咪唑环比较稳定，通过多级质谱裂解，均未发现与其相关的裂解碎片。

负离子模式下，通过多级能量轰击，只有一级分子离子峰［M－H］－m／z 356有一定的响应，ESI－MS2后基本上无响应，分别增加样品浓度和进样量，响应也未发生明显的增加，说明BDH主要通过正离子模式进行裂解产生碎片，负离子模式下则比较稳定，各键不容易发生断裂。这与BDH结构中含有3个N原子有关，容易失去电子而带正电荷。

总之，本研究采用ESI－MSn对BDH的质谱裂解方式做了初步的分析，为BDH的结构修饰及其代谢产物结构判断提供了参考依据。

［1］ Eichbaum M，Bischofs E，Nehls K，et al.Bendamustine hydrochloride－a renaissance of alkylating strategies in anticancer medicine［J］.Drugs Today（Barc），2009，45（6）：431－444.

［2］ National Cancer Institute.Cancer drug information：FDA approval for bendamustine hydrochloride［EB／OL］.（2008－03－20）［2012－02－26］.http：／／www.cancer.gov／cancertopics／druginfo／fda－bendamustine－hydrochloride.

［3］ 佚 名.CHMP推荐批准苯达莫司汀治疗血癌［J］.国外药讯，2010，（4）：18－19.

Anon.CHMP recommended to give approval for bendamustine in the treatment of leukaemia［J］.World Pharm Newsletter，2010，（4）：18－19.In Chinese.

［4］ Schrijvers D，Vermorken J B.PhaseⅠstudies with bendamustine：an update［J］.Semin Oncol，2002，29（4Suppl 13）：15－18.

［5］ Chovan J P，Li Feng，Yu ErYa，et al.Metabolic profile of［14C］bendamustine in rat urine and bile：preliminary structural identification of metabolites［J］.Drug Metab Dispos，2007，35（10）：1744－1753.

［6］ Ogura M，Uchida T，Taniwaki M，et al.PhaseⅠand pharmacokinetic study of bendamustine hydrochloride in relapsed or refractory indolent B－cell non－Hodgkin lymphoma and mantle cell lymphoma［J］.Cancer Sci，2010，101（9）：2054－2058.

［7］ Dennie T W，Kolesar J M.Bendamustine for the treatment of chronic lymphocytic leukemia and rituximab－refractory，indolent B－cell non－Hodgkin lymphoma［J］.Clin Ther，2009，31Pt 2：2290－2311.

［8］ Teichert J，Baumann F，Chao Q，et al.Characterization of two phaseⅠmetabolites of bendamustine in human liver microsomes and in cancer patients treated with bendamustine hydrochloride［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2007，59（6）：759－770.