人Bcl-w基因的克隆和原核表达

戴晓莉，王敏，杜鸿

Bcl-w属于Bcl-2家族，具有抑制细胞凋亡的功能，在肿瘤的发生发展过程中发挥了重要作用［1］，正越来越多地受到肿瘤研究者们的关注。然而，迄今为止，Bcl-w检测的国产化试剂尚未见报道，开展Bcl-w国产化检测试剂盒的研究，无疑将有助于临床肿瘤检测、监控与治疗。本研究从人胃癌组织中扩增出Bcl-w基因，并通过工程菌成功地表达了Bcl-w蛋白，为推进Bcl-w检测的国产化，进一步探讨该重组蛋白在肿瘤治疗中的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Trizol、逆转录试剂盒、pGEM-T载体和质粒提取试剂盒购自Invitrogene公司，LATaq DNA聚合酶、PrimeSTARTMHS DNA聚合酶、dNTP、EcoRⅠ及XhoⅠ核酸内切酶、T4连接酶、核酸标准参照物DL2000和蛋白标准参照物均购自TaKaRa Biotec公司，X-gal和IPTG购自默克公司，琼脂糖购自上海意图公司，显色试剂购自Amershan Biosciences公司，抗His抗体、羊抗小鼠IgG-HRP购自北京中山生物技术有限公司。原核表达载体、大肠埃希菌DH5α和ROS均由本室保存。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取 取人胃癌组织，将其剪碎研磨，加入1 ml Trizol，室温静置5 min后加入0.2 ml氯仿，充分震荡 15 s，室温静置 10 min;4℃12 000×g离心15 min，取上清加入0.5 ml异丙醇，室温静置10 min后4℃12 000×g离心10 min，弃上清，取沉淀加75%乙醇1 ml涡洗2遍，4℃7 500×g离心5 min，充分去除乙醇，干燥至RNA呈半透明状，最后加入20 μl DEPC水将其溶解。

1.2.2 Bcl-w基因的克隆 根据基因库中人Bcl-w基因编码区序列设计特异性引物，上游：5'-CAGAATTCATGGCGACCC-3'，下游：5'-CGCCTCGAGCCACTTGCTAGC-3'，分别带有酶切位点 EcoRⅠ和XhoⅠ，由上海生工生物工程技术有限公司合成。利用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，并以其为模板PCR，利用特异性引物扩增人Bcl-w基因。PCR 反应体系：25 μl 2 × GC 缓冲液 I、6 μl dNTP(2.5 mmol/L) 、2 μl cDNA、0.5 μl LA Taq 酶(5 U/μl) 、1μl P1 及P2 引物、14.5 μl H2O，总体积50 μl。反应条件：94℃预变性5 min，之后94℃变性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸45 s，循环30次，最后72℃延伸10 min。获得的PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色，观察结果。

1.2.3 Bcl-w序列的分析鉴定 胶回收Bcl-w基因的PCR产物，将其T-A克隆入pGEM-T载体，转化感受态细菌，接种于含有氨苄西林、X-gal和IPTG的LB平板，挑取白色菌落增菌，抽提质粒行PCR和酶切双重鉴定。挑取经鉴定得到的阳性标本送测序公司进行测序，将得到的核苷酸序列与基因库中的序列进行比对分析。

1.2.4 人Bcl-w蛋白的表达 将pGEM-T/Bcl-w质粒经EcoR I和Xho I双酶切和胶回收，获得Bcl-w基因片段，连接表达载体pet28a，然后转化大肠埃希菌ROS，取阳性克隆经酶切鉴定与预期结果相符，经测序比对正确后挑取单个菌落增菌过夜，第2天将此菌液以1∶100的比例接种于新鲜培养基中，培养至对数生长期时，加入 IPTG，终浓度分为 0.5，1，1.5，2 mmol/L，培养温度分为25℃、30℃和37℃，诱导时间分为4，6，8 h，在各种条件下分别收集细菌，加入1/10体积的冷PBS，冰浴超声破菌后4℃、12 000×g离心20 min，再分别取上清和沉淀进行蛋白电泳分析，以确定最佳诱导条件。

1.2.5 人Bcl-w蛋白的鉴定 免疫印迹法对所表达蛋白进行鉴定，将SDS-PAGE胶分离蛋白电转移至PVDF膜上，然后用5%的脱脂牛奶封闭1 h，TBS/T洗涤1次，4℃孵育抗His抗体(1∶1 000稀释)过夜，TBS/T洗涤3次，室温孵育羊抗小鼠IgGHRP抗体(1∶400稀释)1 h，TBS/T洗涤3次，最后加显色剂显色并观察结果。

2 结果

2.1 Bcl-w基因扩增结果

提取人胃癌组织总RNA，逆转录获得cDNA，以cDNA为模板，经PCR扩增得到的目的基因长约582 bp(图1)。

图1 Bcl-w基因扩增结果

2.2 重组质粒的筛选与鉴定

将PCR产物经T-A克隆与T载体相连，挑取阳性菌落增菌后抽提质粒，经单、双酶切鉴定，结果见图2。将克隆出的基因测序，获得的核酸序列与基因库中人 Bcl-w序列进行比较分析，同源性为100%。利用酶切位点，将此Bcl-w基因片段连接入原核表达载体pet28a，抽提质粒进行PCR及酶切双重鉴定，所得基因片段与预期相符，成功构建表达载体pet28a/Bcl-w。

2.3 Bcl-w融合蛋白的表达和鉴定

pet28a/Bcl-w阳性ROS菌株的最佳诱导条件为终浓度1 mmol/L IPTG、30℃诱导6 h。结果在相对分子质量22×103处获得大量表达(与预期相符)，用抗His抗体进行免疫印迹鉴定，证实该蛋白条带确为Bcl-w融合蛋白(图3)，并发现该重组蛋白主要以包涵体形式存在。

图2 Bcl-w重组质粒的鉴定

图3 人Bcl-w融合蛋白的表达及鉴定

3 讨论

1984年Tsujimoto等［1］首次于滤泡型B淋巴瘤中分离得到一种新型基因，命名为B细胞淋巴瘤/白血病基因2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)，该基因与细胞凋亡密切相关。目前已发现Bcl-2家族成员超过25个，被分为3类：抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-w等;促凋亡蛋白，包括Bax和Bak等;BH3-only蛋白，包括 Bid和 Bad等［2-3］。正常情况下，细胞内的这3类蛋白处于动态平衡中。

细胞凋亡属于细胞自主性死亡，受到多种基因的调控，在机体的生长发育过程中发挥着重要作用［4］。Bcl-2家族蛋白是调控细胞凋亡的关键性蛋白，越来越多的学者开始利用Bcl-2家族蛋白抑制物来控制肿瘤细胞的生长［5］。作为Bcl-2家族中的抗凋亡因子，Bcl-w通过与家族蛋白及其他相关蛋白之间的作用，发挥着复杂的抗凋亡功能。最新研究表明，在细胞凋亡的刺激下，Bcl-w晶体结构发生改变，形成低聚物二聚体，有助于线粒体外膜通透性的增加［6］。Bcl-w可通过构象改变来调节细胞凋亡，在肝细胞癌、胃癌、结直肠癌等多种肿瘤细胞中表达明显增强［7-9］，在睾丸发育和精子发生过程中有调节生殖细胞周期的作用［10］。同时研究发现，Bcl-w的反义核酸诱导细胞凋亡、抑制消化系统肿瘤细胞生长的效果并不明显［11］。但是，Bcl-w究竟以怎样的方式调控着细胞凋亡，是否需要依赖其他辅助因子?其具体作用机制及通路尚不明确。

本实验成功从人胃癌组织中克隆得到Bcl-w基因CDS区，其序列与基因库中发表的人Bcl-w基因序列完全一致;成功构建了原核表达载体pet28a/Bcl-w，并获得了人Bcl-w融合蛋白，为深入研究Bclw的生物学功能，探讨细胞凋亡的分子机制，研究肿瘤的临床治疗奠定了重要的基础，同时也为推进Bcl-w国产化检测试剂盒的研发提供了可能。

［1］Tsujimoto Y，Gorham J，Cossman J，et al.The t(14;18)chromosome translocations involved in B-cell neoplasms result from mistakes in VDJ joining［J］.Science，1985，229(4720)：1390-1393.

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［3］Ghiotto F，Fais F，Bruno S.BH3-only proteins：the death-puppeteer's wires［J］.Cytometry A，2010，77(1)：11-21.

［4］Peina-Slaus N.Genetic and molecular insights into apoptosis［J］.Acta Med Croatica，2009，63(Suppl 2)：13-19.

［5］Ishitsuka K，Kunami N，Katsuya H，et al.Targeting Bcl-2 family proteins in adult T-cell leukemia/lymphoma：In vitro and in vivo effects of the novel Bcl-2 family inhibitor ABT-737［J］.Cancer Lett，2012，317(2)：218-225.

［6］Lee EF，Dewson G，Smith BJ，et al.Crystal structure of a BCL-W domain-swapped dimer：implications for the function of BCL-2 family proteins［J］.Structure，2011，19(10)：1467-1476.

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［9］Wilson JW，Nostro MC，Balzi M，et al.Bcl-w expression in colorectal adenocarcinoma［J］.Br J Cancer，2000，82(1)：178-185.

［10］Yan W，Huang JX，Lax AS，et al.Overexpression of Bcl-W in the testis disrupts spermatogenesis：revelation of a role of BCL-W in male germ cell cycle control［J］.Mol Endocrinol，2003，17(9)：1868-1879.

［11］蒋建伟，吴风云，何金花，等.靶向 Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bcl-w、A1反义核酸抑制消化系肿瘤细胞增殖效果的差异［J］.中国药理学通报，2010，26(8)：1093-1098.