血管内皮生长因子（VEGF）在血管外膜成纤维细胞的表达研究

沈颉

血管内皮生长因子（VEGF）在血管外膜成纤维细胞的表达研究

沈颉

目的 探讨血管内皮生长因子及其受体在血管壁外膜成纤维细胞的表达。方法 采用ELISA方法来检测外膜成纤维细胞血管内皮生长因子的分泌及TGF-β、bFGF、AngⅡ、PDGF对血管内皮生长因子分泌的影响，使用Western blot法观察TGF-β、bFGF、AngⅡ、PDGF等对血管内皮生长因子I型受体表达的影响。结果 血管外膜成纤维细胞能够分泌血管内皮生长因子。TGF-β能显著增高血管内皮生长因子分泌（n＝5，P<0.05）,而PDGF、bFGF、AngⅡ对血管内皮生长因子分泌比较没有统计学差异（n=5,P>0.05）。TGF-β、PDGF、bFGF、AngⅡ均可刺激外膜成纤维细血管内皮生长因子I型受体表达增高(n=4,P<0.05)。结论 血管壁外膜成纤维细胞可以分泌血管内皮生长因子，血管局部活性物质能有效刺激其受体表达增高。因此推测血管内皮生长因子可能介导血管外膜成纤维细胞参与血管壁的重构。

血管内皮生长因子（VEGF）；血管内皮生长因子I型受体（VEGFR-1）；血管外膜成纤维细胞(AFs)

血萎内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是一类特异性地促进血管内皮细胞生长以及促进血管形成的生长因子，其作为一种有丝分裂原需与特异性受体结合，从而激活一系列的细胞信号通路。VEGF主要与2种酪氨酸激酶受体结合：VEGF 1型受体（vascular endothelial growth factor receptor-1）以及VEGF 2型受体（vascular endothelial growth factor receptor-2）。近期研究表明VEGF及其受体不仅可以在内皮细胞中表达，在许多非内皮细胞也有表达，且在这些非内皮细胞的表达与动脉粥样硬化、高血压血管改变等许多血管性病变密切相关[1-3]。

1996年Shi首次提出外膜重塑(vascular adventitial remodeling)的概念[4]，大量文献证实血管外膜参与血管壁的重塑过程。文献证实TGFβ1能诱导血管外膜成纤维细胞（adventitial fibroblasts,AFs）向肌成纤维细胞转化参与血管新生内膜形成，并发现血管外膜成纤维细胞存在VEGFR-1的表达，且在VEGF刺激下，外膜成纤维细胞迁移活性增强。从而提示VEGF/VEGFR在血管外膜细胞上的表达具有功能上的意义[5]。本研究拟采用ELISA法检测培养的血管外膜成纤维细胞中VEGF分泌，选取TGF-β、bFGF、PDGF、AngⅡ与血管局部病理改变密切相关的刺激因素，观察其对AFs细胞VEGF分泌及VEGFRs表达的影响，为AFs参与血管重构提供更多的实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 清洁级SD大鼠，雄性,体重180～200g：上海BK公司；DMEM培养基、0.25%Trypsin-EDTA、胎牛血清：GIBCO公司；重组人b-FGF(100-18B)，重组人VEGF165（100-20），TGF-β(Cat No: 100-21R)：PeproTech EC Ltd；PDGFBB：R&D system；AngⅡ：Sigma公司；BSA:Sigma公司；多克隆兔抗VEGFR-1抗体（sc-316）、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、单克隆小鼠抗β-actin：Santa Cruz；VEGF ELISA检测试剂盒:晶美生物工程（北京）有限公司。

1.2 细胞培养及鉴定[5]

1.2.1 细胞培养 参照文献采用组织贴壁方法进行血管外膜成纤维细胞的原代培养。具体如下：SD大鼠处死后，开胸取出胸主动脉，于DMEM培养基中分离周围组织后，纵向剪开血管，剥除内膜后，分离中膜层和外膜层，将外膜层剪成1mm2大小的组织块，使用10%胎牛血清的DMEM培养液贴壁培养、传代，本研究使用的细胞为第4～6代成纤维细胞。

1.2.2 细胞鉴定 采用免疫细胞化学技术。将血管外膜成纤维细胞及中膜平滑肌细胞悬液分别滴种于盖玻片上，放于细胞培养箱中，待细胞生长至适当密度取出，作以下处理：吸弃培养液，PBS漂洗3次，95%乙醇4℃固定10min，PBS漂洗3次，加封闭液室温下作用20min，去封闭液，加1:100小鼠抗α-SM actin单抗37℃作用2h，PBS漂洗3次，加1:200辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG室温下孵育1h，PBS漂洗3次，加DAB显色，显微镜下观察，适时终止反应，常规脱水，透明封片。

血管外膜成纤维细胞α-SM actin免疫染色呈阴性，而中膜平滑肌细胞表达α-SM actin呈阳性。

1.3 AFs细胞培养上清液中VEGF的分泌

1.3.1 细胞分组 将血管外膜成纤维细胞接种于φ6cm培养皿，予不含血清的DMEM培养液静止48h后，共分2组：一组予2mL不含血清的DMEM培养液于普通CO2培养箱分别培养3、6、12、24、48、72h；另一组分别予2mL不含血清的DMEM培养液、2mL含10ng/mL TGF-β的DMEM培养液、2mL含10ng/mL bFGF的DMEM培养液、2mL含10ng/mL PDGF的DMEM培养液、2mL含10-7 AngⅡ的DMEM培养液于CO2培养箱培养24h；依次收集细胞的上清液。经低温冷冻机干燥后用400μl无菌蒸馏水复溶[6]。

1.3.2 ELISA检测 使用ELISA试剂盒测定细胞培养上清液中血管内皮生长因子含量。根据试剂盒说明制作标准曲线，取100μl样品加入已包被抗血管内皮生长因子单抗的酶标板上，充分混匀后置37℃温度下反应90min，洗板后加入生物素化的一抗1h，再次洗板后加入酶标二抗30min，然后加入酶底物15min，测定吸光度。计算样品中VEGF的含量[7]。

1.4 Western blot法测定VEGFR-1表达 待血管外膜成纤维细胞培养至亚融合状态，予不含血清的DMEM培养液培养48h。分别给予空白DMEM（对照）或含10ng/mL TGF-β、10ng/mL bFGF、10ng/mL PDGF、10-7M AngII的DMEM培养基刺激24h。抽提细胞总蛋白。电泳后转膜，以脱脂奶粉封闭，标一抗（VEGFR-1，1:500）4℃过夜,二抗为辣根过氧化物酶标记抗体，于室温下振摇约1h，X光压片曝光后分析[5]。

2 结果

2.1 细胞鉴定 免疫细胞化学结果显示:α-SM actin在血管平滑肌细胞呈阳性染色(棕黄色),而95%血管外膜成纤维细胞基本无着色,呈阴性（图1）。

图1 血管外膜成纤维细胞(上)、中膜平滑肌细胞（下）α-SM actin免疫组化染色图（×200）。平滑肌细胞胞浆内可见到α-SM actin表达的棕黄色阳性染色，成纤维细胞中几乎无阳性染色。

图2 血管外膜成纤维细胞VEGF的分泌。A:细胞在无血清DMEM中培养0、3、6、12、24、48、72h后细胞上清液中VEGF分泌。B:细胞静止48h后，在空白DMEM中培养24h及10ng/mL TGF-β、10ng/mL bFGF、10ng/mL PDGF、10-7AngⅡ刺激24h后细胞上清液中VEGF分泌。aP<0.05。

2.2 血管外膜成纤维细胞分泌VEGF ELISA结果（图2）：AFs细胞能够分泌VEGF。根据文献所示，TGF-β、bFGF、PDGF在10ng/mL左右对成纤维细胞的作用活性最大，而AngⅡ在10-7左右活性最大[5,8]。TGF-β能显著刺激AFs细胞的VEGF分泌（P<0.05）,bFGF、PDGF、AngⅡ对AFs细胞VEGF分泌影响不显著（P>0.05）。

3.3 VEGFR-1在AFs细胞的表达 文献证实血管外膜成纤维细胞存在VEGFR-1蛋白表达[5]。Western blot图象分析示：TGF-β、bFGF、PDGF、AngⅡ均可有效刺激AFs细胞VEGFR-1表达增高(n=4,P<0.05)。

图3 VEGFR-1蛋白条带位置在约180kD处。以空白DMEM作对照，10ng/mL TGF-β、10ng/mL bFGF、10ng/mL PDGF、10-7AngⅡ刺激AFs细胞对VEGFR-1表达影响的蛋白免疫分析图。上图为蛋白免疫印迹图谱，下图为灰度分析统计图。与对照比较，aP<0.05,bP<0.01，n=4。

3 讨论

既往，人们一直认为VEGFRs是局限于血管内皮细胞表达，许多关于VEGFRs的研究则都主要围绕内皮细胞进行[1]。而后，越来越多的实验证明VEGF/VEGF受体存在于在许多非内皮细胞。如：许多肿瘤细胞可表达VEGF受体。VEGF 2型受体可在造血干细胞、视祖细胞上表达。VEGF 1型受体在单核细胞、血管平滑肌细胞、中性粒细胞、肾间充质细胞等均有表达[1,9-10]。VEGF/VEGF受体在非内皮细胞的这种表达，还能介导细胞的许多生物学功能。如存在于单核细胞上的VEGF 1型受体能调节细胞化学趋化性及组织因子的释放[10]；VEGF能促使血管平滑肌细胞分泌基质蛋白，促进其迁移功能增强等，骨髓祖细胞上的VEGFR-1介导细胞活化、动员等[11]。而这些细胞的功能与血管重塑、动脉粥样硬化[1]等慢性炎性病变密切相关。由此可见，研究VEGF/VEGF受体在非内皮细胞表达有非常重要的意义。

本研究结果显示：血管外膜成纤维细胞能够分泌血管内皮生长因子。为了研究血管外膜成纤维细胞上的VEGFR-1是否与血管局部的病理改变有关。选取TGF-β、bFGF、PDGF、AngⅡ等刺激因素。这些因素的作用与许多血管局部病变密切相关[12-13]。结果表明，这些因素均能促使血管外膜成纤维细胞的VEGF 1型表达增高，且TGF-β的作用最为显著，同时ELISA结果所示TGF-β能显著刺激VEGF的分泌。文献证实TGF-β可通过影响血管外膜细胞增殖及肌成纤维细胞表型转化等机制从而参与血管重塑[14]。因此推测VEGF可能也参与了这一机制。

在血管壁局部病理情况下，局部细胞环境的改变以及局部血管活性物质增高可刺激血管外膜成纤维细胞血管内皮生长因子分泌[15]增高以及内皮生长因子1型受体表达增高，而血管内皮生长因子则可以自分泌的形式刺激血管外膜细胞激活，迁移活性增强，这可能也是动脉粥样硬化、血管重塑等病变的机制之一。

本研究存在一定的局限性。首先，研究结果未经过VEGF特异性拮抗剂拮抗VEGF的功能来证实。其次，其具体信号传导机制还有待进一步研究阐明。这将是我们今后进一步研究的方向。

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Objective To explore the expression of VEGF and its receptors in adventitial fi broblasts. Methods Aortic adventitial fi broblasts from Sprague-Dawley (SD) rats were cultured. VEGF were measured in AFs by enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA), and TGF-β, bFGF,PDGF, AngⅡ on the VEGF secretion. the effect of TGF-β, bFGF, PDGF, AngⅡon the expression of VEGFR-1 was detected by western blot. Results Secretion of VEGF by adventitial fi broblasts. ELISA results showed that the VEGF protein was expressed in cultured serum-free medium (SFM) in time dependent manner(n=4, F=59.538,P=0.000)， and TGF-β can signifi cantly increase the VEGF expression. It suggested that VEGF can be secreted from fi broblasts into conditional medium.Western blot results showed that VEGFR-1 was expressed in fi broblasts. TGF-β(n=4,P＜0.01) , bFGF, PDGF,AngⅡ(n=4,P＜0.05) can increase the VEGFR-1 expression. Conclusion Our results demonstrated the existence of VEGF and its receptor VEGFR-1 in adventitial fi broblasts. This might be an important mediator in the pathogenesis of vascular remodeling.

VEGF（Vascular endothelial growth factor）, VEGFR-1（Vascular endothelial growth factor receptor 1）, Adventitial Fibroblasts(AFs).

10.3969/j.issn.1009-4393.2012.24.013

200051 上海市长宁区同仁医院 （沈颉）