发酵食品中氨基甲酸乙酯检测的研究进展

刘功良，陶嫦立，白卫东 *，赵文红，王姣姣

(1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510225；2.广东药学院 生命科学与制药学院，广东 广州 510006）

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）可由氢氰酸、尿素、瓜氨酸、N-氨甲酰基复合物（氨甲酰磷酸盐）等前体物质与乙醇反应得来，此反应可在食品在发酵和贮藏的过程中自发进行[1-2]。EC在腐乳、面包、酸奶、奶酪、酱油、醋和酒精饮料等发酵食品中都被检出[3-4]，其质量浓度变化范围为ng/L（或ng/kg）至mg/L[5-6]。

EC对人体具有潜在的致癌性，可从肠道和皮肤被快速吸收，吸收程度接近100%[7]。世界卫生组织国际癌症研究署已将氨基甲酸乙酯划列为2A类的致癌物[8-9]。联合国粮农组织和世界卫生组织下的食品添加剂联合专家委员会规定EC的基准剂量可信限的下限值为每天0.3mg/kg从面包、发酵乳制品和酱油中EC的平均摄入量每天不超过15ng/kg；包括酒精饮料在内，EC的平均摄入量每天不超过80ng/kg[6]。

由于氨基甲酸乙酯的危害作用及其在发酵食品中广泛存在，检测发酵食品中氨基甲酸乙酯的含量对食品安全以及人体健康具有重要意义。文章对发酵食品中氨基甲酸乙酯检测的预处理，检测方法的种类及优缺点进行综述。

1 样品预处理方法

发酵食品中营养丰富，基质种类众多，很容易对检测结果造成干扰，因此，在采用仪器分析方法检测EC的含量之前，通常需要对发酵食品进行预处理，将其所含的EC提取出来，尽可能分离纯化。常用的预处理方法主要有液/液萃取、固相萃取、固相微萃取和顶空固相微萃取等。

1.1 液/液萃取

现有标准测定方法，如进出口商品检验标准“出口酒类中氨基甲酸乙酯残留量检验方法”（SN0285-1993）中采用的即为溶剂萃取法（LLE），该预处理方法过程比较复杂，操作繁琐，所需时间也较长，无法实现自动化分析，且色素等杂质会影响实验结果，不能满足目前的快速准确分析检测需要[4，10]。

1.2 固相萃取

国际葡萄与葡萄酒组织（OIV）、美国官方分析化学师协会（AOAC）和欧盟（EU）推荐的饮料酒中EC的标准检测方法，均采用固相萃取（SPE）作为预处理方法。与液液萃取相比，SPE方法具有速度较快、成本低、回收率高等优点，但操作较烦琐，样品预处理需1h左右，在产品规模化检测时速度较慢，且需用使用一定危害的有机溶剂，不利于分析人员的身体健康[11-12]。

1.3 顶空固相微萃取

顶空固相微萃取（HS-SPME）是最近被采用的预处理方法之一，该方法不需要人工预浓缩，样品预处理能在5min内完成，自动便捷、快速高效，适合规模化测定，且无需有机溶剂，安全环保。SPME和气相色谱联用，再与高灵敏度的检测器如质谱、电子捕获检测器、原子发射光谱检测器结合，可使检出限达到μg/L～ng/L的级别。多次顶空固相微萃取（MHS-SPME）能够克服通常存在于SPME分析中的基质干扰效应，尤其适合于大量不同基质的样品分析[13-14]。

2 氨基甲酸乙酯的检测方法

发酵食品经过预处理后，通常采用气相色谱-质谱联用法检测氨基甲酸乙酯的含量，除此之外，还有高效液相色谱法、傅里叶变换红外光谱检测法、核磁共振分光检定法、时间分辨荧光免疫分析法等。

2.1 气相色谱法

王立媛等[15]建立了一种同位素稀释-气相色谱-质谱联用检测方法用于腐乳中氨基甲酸乙酯含量，该方法的加标回收率在89%～99%，相对标准偏差（RSD）小于10%，最低检测限达到2.0μg/kg，可作为腐乳中氨基甲酸乙酯含量检测的确证方法。HORIIS等[16]结合顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用，建立并优化了一种方法用以检测酒精饮料中EC的含量，检测限为6.7μg/L，检测结果的相对标准偏差为0.4%～2.0%，回收率为103.6%～107.6%。何碧英等[17]将结合固相分散萃取与气相色谱-质谱联用，建立了一种检测氨基甲酸乙酯的方法，并定量检测了葡萄酒、苹果醋、酸奶、酱油等发酵食品中的氨基甲酸乙酯的含量，为发酵食品中氨基甲酸乙酯的危险性评估提供了科学数据。张燕等[18]建立了一种固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HSSPME-GC/MS）方法，用以检测酱油中氨基甲酸乙酯的含量，方法的检出限（S/N=3）为1.0μg/L，酱油中氨基甲酸乙酯的回收率为70.56%～129.21%，检测结果的日内相对标准偏差（RSD）为3.69%，日间RSD为8.50%。张雪娜等[13]建立了多次顶空固相微萃取-气相色谱法（MHS-SPME-GC）用以检测多种酒精饮料中EC的含量。该方法的检测线性范围为0.04mg/L～100mg/L，线性相关系数为0.9997，检出限为34μg/L；重复实验所得相对标准偏差为2.19%；准确度高，加标回收率在90.9%～103.6%。

气相色谱-质谱联用是检测发酵食品中氨基甲酸乙酯含量的常用方法，预处理简单，成本相对较低，检测技术较为成熟，应用范围广，可作为标准方法进行推广。

2.2 高效液相色谱法

PARK SK等[19]使用高效液相色谱串联质谱，建立了一种检测韩国酱油产品中EC含量的方法，当EC的质量浓度在10μg/L～100μg/L和0.1μg/L～20μg/L范围内变化时，该方法具有良好的线性关系，加标的平均回收率为（92.2±1.7）%。MADRERA RR等[20]利用高效液相色谱结合荧光检测器（HPLC-FLD），建立了一种检测苹果类酒精饮料中EC含量的方法，检测曲线的线性相关系数超过0.9999，检测限与定量限值分别为1.64μg/L和3.56μg/L，回收率为94%～98%，检测结果的变异系数不超过5%[20]。YE CW[14]结合多重顶空固相微萃取与气相色谱/氮磷检测器，建立并优化了一种检测不同酒精饮料中EC含量的方法，检测限为0.034mg/L，线性范围为0.04mg/L～100mg/L，检测结果的RSD为2.19%，线性相关系数为0.9997。FU M L等[21]使用HPLC-FLD建立了一种检测中国黄酒中EC含量的方法，检测结果的线性相关系数为0.9990，该方法的检测限和定量限为73.2μg/L和243.9μg/L，加标回收率为98.30%～101.30%，检测方法的准确度（RSD）不超过5%。诸葛庆等[22]建立一种反相高效液相色谱法测定黄酒中氨基甲酸乙酯的方法。EC的质量浓度在50.0μg/L～250.0μg/L范围内，该方法的平均回收率为92.9%，RSD为4.5%（n=6），检出限为10μg/L，线性范围为100μg/L～1500μg/L（R=0.9995），测定结果与标准气相色谱-质谱法基本相同。

高效液相色谱在检测EC之前，需要柱前衍生，成本较高，且不如GC-MS法灵敏，因此其应用范围不如GC-MS广。

2.3 傅里叶红外光谱法

LACHENMEIERD W[23]利用偏最小二乘法结合傅里叶变换近红外光谱，建立了一种快速检测核果类酒精饮料中EC含量的方法。除了能检测样品中EC的含量之外，傅里叶变换红外光谱法还能显示EC的前体物质氢氰酸和贮藏过程中EC含量的最大值等相关信息，但在定量检测方面，该方法的准确度和精确度很低，只能用于筛分分析过程中的半定量检测。通过使用该方法，60%～70%的样品可以被鉴定为阴性样品，剩余的样品可使用操作复杂、劳动强度高的参照分析方法定量检测EC的含量。

随着研究的深入，傅里叶红外光谱（FTIR）方法的灵敏度和精密度的进一步提高，FTIR方法必将是EC检测快速、方便的一种检测方法，但目前，这种快速检测方法不能满足发酵食品中EC限量标准的测定要求。

2.4 核磁共振分光检测法

MONAKHOVA Y B等[24]利用偏最小二乘回归结合核磁共振色谱，建立了一种检测核果类饮料中EC含量的方法，该方法的灵敏度和特异性均要高于基于近红外光谱或傅里叶变换红外光谱建立的筛选技术，其准确度足够用于定量检测含0～1mg/L范围（欧洲委员会推荐）氨基甲酸乙酯的样品。

与气相色谱结合串联质谱方法相比，该方法省时，除了与含有内标的缓冲溶液混合之外，该方法甚至无需额外的样品制备步骤，但该方法所需仪器设备昂贵，维护成本高。

2.5 时间分辨荧光免疫分析方法

徐岩等[25]以氨基甲酸乙酯-牛血清白蛋白作为免疫原获得多克隆抗体，以氨基甲酸乙酯-卵清蛋白为包被抗原，利用制备的抗氨基甲酸乙酯多克隆抗体，用Eu3+标记的羊抗兔抗体进行示踪，建立了时间分辨荧光免疫分析方法用以检测酒类中氨基甲酸乙酯的残留，该方法的灵敏度为3.26μg/L，平均回收率为92.4%，同一批次内和不同批次间检测的变异系数分别为3.3%和6.7%，检测范围为1μg/mL～20μg/mL。该方法与甲氨、刀豆氨酸等存在一定程度的交叉反应，检测的特异性有待进一步提高。

3 结论

氨基甲酸乙酯的传统检测方法尽管具有很高的灵敏度和可靠性，但也存在一些缺陷：样品预处理的程序比较复杂，检测成本高，时间长，检测过程只能在具有大型、贵重仪器的专业实验室内进行，难以适应市场产品的现场抽查、生产企业的自查及产品进出口快速通关检测的要求[26]。建立无损伤检测方法及研发方便实用的快速检测试剂盒是发酵食品中EC含量检测迫切需要解决的问题[27]。酶联免疫吸附检测具有特异性高、灵敏度高、快速简单、成本划算等优点[28]，可作为色谱和光谱等分析方法的补充，尤其是其能同时检测大批量样品、具有高通量筛选的能力，成为定性筛选和定量分析的工具，显示出替换传统仪器分析的应用前景[29]，能为发酵食品中氨基甲酸乙酯残留的高通量快速检测提供简单有效的途径。

随着细胞融合技术、DNA重组技术、单链重组抗体技术和噬菌体展示技术等抗体制备技术的飞速发展，人们开始用基因工程的方法制备基因重组抗体。氨基甲酸乙酯酶联免疫检测技术以其自身的优势和在方法上的不断完善，必将在氨基甲酸乙酯的快速检测方面发挥愈来愈重要的作用。

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