烟草突变体筛选与鉴定方法篇：5.烟草耐低钾突变体的筛选与鉴定

王 倩

（中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101）

烟草是喜钾作物。除了作为重要的营养元素发挥作用外，钾与烟草的抗逆性、抗病虫害能力密切相关；钾含量也是烟叶品质评价的重要指标之一。基于钾素的重要性和我国土壤普遍低钾的国情及国内烟叶钾含量低的现状，开展烟草钾营养基础研究、选育耐低钾/钾吸收高效型烟草品种等工作极为迫切[1]。为此，烟草基因组计划重大专项 2012年研究项目“烟草突变体筛选与鉴定”建立了烟草耐低钾突变体的高通量筛选方法，并开展了烟草耐低钾突变体的大量筛选工作。

1 烟草耐低钾突变体的高通量筛选方法的建立

可见表型突变体通过外观表型可较为容易地获得；与之不同，植物营养突变体的筛选相对复杂。筛选体系需要一个明确的筛选指标和合适的筛选条件，使得目标突变体具备明显的性状，从而区别于其他非突变植株。遵循高通量、快速、简易的筛选原则，耐低钾突变体筛选采用负筛选的策略，即利用组织培养技术，减少生长所必需的钾元素[2]。因耐低钾突变体比正常烟草更具有生长优势，从而被筛选获得。拟南芥、小麦等植物的营养性状突变体筛选过程中均采用了类似的筛选体系[3-4]。

1.1 低钾培养基的配制

低钾培养基的配制参照拟南芥钾营养突变体的筛选方法[5]。以正常MS培养基为基础，去除KNO3以NH4NO3部分替换，去除 KH2PO4以等浓度 NH4H2PO4替换。其大量元素的具体组成如下：2300 mg/L NH4NO3，370 mg/L MgSO4·7H2O，144 mg/L NH4H2PO4，440 mg/L CaCl2·2H2O。微量元素、铁盐、琼脂、蔗糖的加入量保持不变。经测定，不外加钾的MS培养基（无钾培养基）的钾本底含量为50 μM。试验中培养基的钾浓度根据需要用KNO3调节。

1.2 烟草耐低钾突变体筛选时期的确定

耐低钾突变体的筛选条件可简单划分为两方面：突变体的筛选时期和生长环境中的钾浓度。对烟草而言，烟草种子具有体积小、易于消毒、发芽时间短等特点，因此选择烟草幼苗进行突变体筛选比较合理。同时，成株期烟苗由于种植面积大、中间环节多，不适合用于高通量筛选。

1.3 烟草耐低钾突变体筛选指标的确定

本体系选取对环境中钾浓度变化较为敏感的烟草性状作为筛选指标。在筛选压力下，突变体具有忍受钾胁迫的能力可以正常生长，而非突变体则生长受到抑制。野生型烟草种子消毒后单粒点种于1/2 MS培养基，将6 d苗龄的烟草幼苗转移至不同钾浓度的低钾培养基中，对其生长状况进行观察发现，烟草幼苗的根部生长对外部钾浓度变化较为敏感，而其冠部生长受钾浓度变化影响相对较小。随着培养基中钾浓度的降低，烟草根系生长速度减慢。因此，选择幼苗的根系生长作为筛选指标。为便于观察，将幼苗根尖向上倒立竖直培养，在向地性的作用下，如果根伸长则向下弯曲生长。把根发生弯曲的个体挑选出来作为可能的突变体。以根的向地性弯曲生长为筛选指标的方法已在拟南芥和其它作物钾、钠、镉、铵等营养突变体的筛选中得到成功应用[6-9]。

1.4 烟草耐低钾突变体筛选压力（临界钾浓度）的确定

合适的筛选压力是筛选顺利的关键。烟草耐低钾突变体筛选临界钾浓度是指可维持烟草幼苗生存且能较好地体现植株缺钾性状的钾浓度，也即能够完全抑制野生型烟草幼苗主根生长的最高钾浓度。

野生型烟草种子消毒后单粒点种于1/2 MS培养基，待主根伸长至1 cm左右时，将幼苗转移至不同钾浓度低钾培养基上，根尖向上倒立竖直培养。在向地性的作用下，如果根伸长则向下弯曲生长。定期测量不同钾浓度下幼苗的弯根长度。经多次重复试验与统计分析，确定烟草外加钾浓度为75 μM时，野生型烟草幼苗主根生长完全被抑制。因此，选取125 μM 钾浓度（无钾MS培养基本底钾浓度50 μM + 外加钾浓度75 μM）为烟草耐低钾突变体的筛选压力。

2 烟草耐低钾突变体的高通量筛选

2.1 烟草耐低钾突变体的高通量初步筛选

将EMS（甲基磺酸乙酯）处理的烟草突变体二代种子消毒后，单粒点播于1/2 MS培养基。每份材料点播40～50粒。以未经EMS处理的野生型烟草种子作对照。待主根生长至1 cm左右时，将幼苗转移至外加钾浓度为75 μM的低钾培养基上，根尖向上倒立竖直培养，10～20 d内观察记录各突变体主根生长情况。根出现明显弯曲生长的幼苗为可能的耐低钾突变体。将筛选到的可能的耐低钾突变体幼苗转移至MS培养基中培养。待根系生长茁壮后，移栽于营养土中，种子成熟后采收第3代种子。期间对突变体的田间表型进行观察和描述。

2.2 烟草耐低钾突变体的进一步筛选

为剔除试验误差、保证筛选结果的准确性，利用2.1中的筛选方法对耐低钾突变体3代种子进行复筛。100%表现为上一代耐低钾性状的株系为耐低钾突变体。该部分工作可大幅度降低后续鉴定环节的工作量。

3 烟草耐低钾突变体的获得及突变基因功能鉴定

3.1 突变体的生理性状分析

筛选所获得的耐低钾突变材料需对其性状进行更加细致的分析测定，包括突变体的植株生物量、根冠生物量、根冠鲜重、植株钾含量、主侧根长度、根系钾吸收速率及利用率等，也可通过改变培养基中的钙、磷等营养成分，观察其生长变化，为后续的功能研究提供信息[10-11]。

3.2 突变基因功能鉴定

突变体的表型变化是由一个或多个基因的突变导致的，因此，耐低钾突变体研究最终要定位到具体的突变基因。以野生型为父本，性状稳定的突变体为母本，进行杂交，通过对F1代耐低钾性状检测，确定突变性状的显隐性。通过低钾筛选统计F2代的耐低钾表型，分析其分离比例。建立遗传分离群体，筛选与目标基因紧密连锁的分子标记，采用正向遗传学方法获得突变基因。过表达或干扰该基因在烟草中的表达，通过检测植株的耐低钾性状，确定基因的功能。在拟南芥的钾营养研究中，利用上述策略成功克隆并解析了蛋白激酶 CIPK23、AtKC1的功能，通过对上下游互作研究，提出了拟南芥低钾胁迫反应通路，即Ca2+-CBL-CIPK23信号通路[4,12-13]。

[1]杨铁钊，舒海燕，赵献章.我国烟草钾素营养研究现状与进展[J].烟草科技，2002（7）：39-43.

[2]刘贯山.烟草突变体筛选与鉴定方法篇：1.烟草突变体的筛选与鉴定[J].中国烟草科学，2012，33（1）：102-103.

[3]杨振明，李秋梅，王波，等.耐低钾冬小麦基因型筛选方法的研究[J].土壤学报，1998，35（3）：376-383.

[4]Xu J, Li H D, Chen L Q, et al.A protein kinase, interacting with two calcineurin B-like proteins, regulates K+ transporter AKT1 in Arabidopsis[J].Cell, 2006, 125(7): 1347-1360.

[5]李皓东.拟南芥钾营养突变体的筛选和低钾敏感基因LKS1的功能与分子调控机制研究[D].北京：中国农业大学，2005.

[6]邹娜，李保海，董刚强，等.铵减弱拟南芥主根向地性及其相关作用途径[J].植物生理学报，2011，47（11）：1109-1116.

[7]欧红梅，张自立，吴群.拟南芥矿质元素突变体的筛选及基因定位综述[J].作物研究，2005（5）：409-413.

[8]Howden R, Cobbett C S.Cadmium-sensitive mutants of Arabidopsis thaliana[J].Plant Physiol, 1992, 100(1): 100-107.

[9]Li Q, Li B, Kronzucker H, et al.Root growth inhibition by NH4+ in Arabidopsis is mediated by the root tip and is linked to NH4+ efflux and GMPase activity[J].Plant Cell Environ, 2010, 33(9): 1529-1542.

[10]彭克勤，彭志红，萧浪涛，等.水稻耐低钾变异后代的根系生理研究[J].中国农学通报，2003，19（5）：64-66.

[11]王晓光，曹敏建，王伟，等.钾对大豆根系形态与生理特性的影响[J].大豆科学，2005，24（2）：126-129.

[12]Wang Y, He L, Li H D, et al.Potassium channel α-subunit AtKC1 negatively regulates AKT1-mediated K+uptake in Arabidopsis roots under low-K+stress[J].Cell Res, 2010, 20: 826-837.

[13]Li L, Kim B G, Cheong Y H, et al.A Ca2+signaling pathway regulates a K+channel for low-K response in Arabidopsis[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(33): 12625-12630.