梓苷的抗肿瘤活性研究

王奇志，管福琴，孙浩，陈雨，赵友谊，冯煦，王鸣

(江苏省中国科学院植物研究所南京中山植物园江苏省药用植物研究开发中心，江苏南京210014)

梓实系紫葳科Bignoniaceae梓属CatalpaL.植物梓Catalpa ovataG.Don的果实［1］，产于湖南、河北、四川、东北等地。梓属树皮习称梓白皮，果实称梓实，均供药用，《本草钢目》记载具有清热、解毒、致泻、杀三虫和利尿的功能。近代药理研究表明除利尿外尚有抗痉挛、降血糖、抗饱胀感和增强抗癌药作用的功效［2-6］，梓实中主要活性成分为环烯醚萜苷［7-14］，如梓醇和梓苷(结构见图1)。本实验对梓苷的生物活性进行了深入研究，现将抗肿瘤的结果报道如下。

1 材料

1.1 实验动物昆明种小白鼠，体质量18～22 g，雌雄各半，由南京青龙山动物饲养中心提供，合格证:SCXK(苏)2002-0018。

1.2 肿瘤模型小鼠移植性肿瘤模型，肉瘤180(S180)、肝癌(Heps)均从中国科学院上海药物研究所引进，江苏省肿瘤防治研究所传代保种，人胃癌细胞由江苏省肿瘤防治研究所提供，来自胃癌病人手术标本制成的癌细胞悬液(未鉴定)。

1.3 药材来源梓实鲜品20 kg于2010年10月采自南京中山植物园，经江苏省中国科学院植物研究所袁昌齐研究员鉴定为紫葳科梓属植物梓Catalpa ovataG.Don的果实。

图1 梓苷的化学结构式Fig.1 Structure of catalposide

1.4 药品及试剂梓苷自行分离，经HPLC归一化法测定纯度大于95%，5-氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇(TaX)、甲氨蝶呤(MTX)、盘尼西林(HePT)、鬼臼乙叉苷(VP16)均由江苏省肿瘤防治研究所提供。

1.5 仪器设备超净台(苏州净化设备公司YJ875)，电子分析天平(赛多利斯公司)，恒温水浴锅(上海精密实验设备有限公司，DK-8A型)。

2 实验方法

2.1 样品制备梓实干品5 kg，80%乙醇热提3次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩成0.75 kg浸膏，加水500 mL悬浮，分别用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，得正丁醇部位120 g，经大孔树脂(D101)吸附，乙醇-水梯度洗脱，收集30%乙醇洗脱部分，通过硅胶柱色谱［三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，收集三氯甲烷-甲醇(5∶1)洗脱部分］、再经Sephadex LH-20柱(甲醇洗脱)重结晶得梓苷纯品(15 g)。

白色针晶(甲醇)，mp 145～146℃，［α23D］-184(c 1.0，MeOH)，易溶于甲醇、乙酸乙酯和DMSO，可溶于水。TLC上喷5%H2SO4-EtOH液显灰褐色斑点。UVλMeOHmax(nm):260(4.27)，303(1.37)。API-ESI(+)MS:505［M+Na］+(100)。IRνKBrmax(cm－1):3 409，2 928，2 891，1 698，1 653，1 607，1 590，1 515，1 452，1 356，1 279，1 169，1 065，968，928，860，770，701，639，508，413。ESI(+)MS(m/z):505［M+Na］+(100)。1H-NMR(300 MHz，DMSO-d6)δ:2.59(1H，m，H-5)，2.69(1H，m，H-9)，3.34-3.45(4H，m，H-2'～5')，3.52(1H，d，J=13.2 Hz，H-6'a)，3.73(1H，m，H-7)，3.76(1H，d，J=12.8 Hz，H-10a)，3.87(1H，d，J=13.2 Hz，H-6'b)，4.05(1H，d，J=12.8 Hz，H-10b)，4.83(1H，d，J=7.8 Hz，H-1')，4.98(1H，dd，J=5.8，5.9 Hz，H-4)，5.07(1H，d，J=5.8 Hz，H-1)，5.09(1H，dd，J=7.8，4.4 Hz，H-6)，6.33(1H，d，J=5.9 Hz，H-3)，6.86(2H，dd，J=8.8，2.9 Hz，H-3″和H-5″)，7.89(2H，dd，J=8.5，2.9 Hz，H-2″和H-6″)，10.43(1H，s，4″-OH，加D2O消失)。13C-NMR(75 MHz，DMSO-d6)δ:93.6(C-1)，140.7(C-3)，101.7(C-4)，34.8(C-5)，79.4(C-6)，58.6(C-7)，65.3(C-8)，41.6(C-9)，60.4(C-10)，98.2(C-1')，73.0(C-2')，76.3(C-3')，70.0(C-4')，76.2(C-5')，61.5(C-6')，120.0(C-1”)，131.5(C-2″和C-6″)，115.0(C-3″和C-5″)，161.9(C-4″)，165.9(CO)。与文献［4-7］报道的数据一致。

2.2 体内抗肿瘤作用按《抗癌药物药效学研究指导原则》方法进行。选择肿瘤生长良好且无溃破的肿瘤小鼠，在无菌条件下取出肿瘤，用0.9%NaCl按1∶4稀释(1×108个/mL)制成瘤细胞悬液，每只小鼠于前肢腋窝皮下接种0.2 mL，接种后随机分组，每组雌雄各半。次日开始给药，每日1次，连续8 d，第9天称体质量、解剖、剥离瘤块，取出脾脏、胸腺，分别称质量，计算抑瘤率、脾指数和胸腺指数。

2.3 体外杀伤作用癌症病人手术标本，制成癌细胞悬液，每日加药一次，连续5 d，采用MTT法测定每孔OD值。

2.4 统计方法组间比较采用t检验。

3 结果与分析

3.1 梓苷对小鼠移植性肿瘤的抑瘤作用当剂量为25 mg/kg时，对S180的抑制率为60.68%，超过了阳性对照5-FU(55.56%);对Heps抑制率为50.80%。结果说明梓苷对小鼠移植性肿瘤S180、Heps有明显的抑制作用和极显著性差异(P＜0.001)，见表1，其中对S180的抑制作用大于对Heps的。

表1 梓苷对小鼠移植性肿瘤的抑制作用(n=10)Tab.1 Inhibition of catalposide on transplanted tumor in m ice(n=10)

3.2 梓苷对免疫器官质量的影响梓苷对荷瘤(S180)、(Heps)小鼠免疫器官质量都有一定的提高，与空白比较无显著性差异，而阳性对照药5-FU则有所降低，说明梓苷在发挥抗癌作用的同时不抑制免疫功能，效果比5-FU好。见表2、3。

表2 梓苷对荷瘤(S180)小鼠免疫器官质量的影响(n=10)Tab.2 Effects of catalposide on immune organs weight of S180-bearing m ice(n=10)

表3 梓苷对荷瘤(Heps)小鼠免疫器官质量的影响(n=10)Tab.3 Effects of catalposide on immune organs weight of Heps-bearing m ice(n=10)

4 讨论

梓苷是梓实的主要活性成分之一，约含2%，传统临床应用梓实利尿，治疗糖尿病。本实验首次对梓苷的抗肿瘤活性进行研究，发现梓苷对小鼠移植性肿瘤肉瘤(S180)和肝癌(Heps)均有明显的抑制作用。当梓苷剂量为25 mg/(kg·d)灌胃给药时其抑制率分别为60.68%和50.80%，高于或相当于阳性药5-Fu的抑制率。研究结果表明梓苷在动物体内具有较强的抗肿瘤活性，对荷瘤小鼠的脾指数和胸腺指数无明显影响，说明梓苷在发挥抗癌作用的同时，不抑制免疫功能。

利用江苏省肿瘤防治研究所的实验条件，通过对人源性胃癌靶细胞体外的直接杀伤作用实验的研究，发现梓苷对人癌细胞的体外杀伤作用不明显(表4)，说明梓苷对癌细胞生长的抑制作用不是直接的杀伤作用，其抗癌的作用机理有待进一步探讨。

表4 梓苷对人癌细胞的体外杀伤作用(n=3)Tab.4 Killing for human cancer cells in vitro of catalposide(n=3)

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