HPLC法测定己烯雌酚乳膏中己烯雌酚的含量

张建国，何 婧

己烯雌酚是人工合成的非甾体雌激素物质，为无色结晶或白色结晶性粉末［1］，可用于绝经期综合征、卵巢功能不全引起的各种疾病、前列腺癌及老年性阴道炎等，也可用于前列腺癌［2］。目前，己烯雌酚原料及其制剂的HPLC含量测定方法在2010版中国药典都有记载［3］，也有文献报道［4-7］。己烯雌酚乳膏是本院临床长期使用的一种疗效优良的医院制剂，为有效控制本品质量，笔者通过实验建立了操作简便、定量准确、专属性强的HPLC法用于本品的含量测定，获得满意结果。

1 仪器与试药

戴安Ultimate3000型高效液相色谱仪(德国戴安公司);数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司，KQ-100DB);电子分析天平(岛津AEU-210型电子天平，d=0.1 mg);己烯雌酚对照品(中国药品生物制品鉴定所提供，供含量测定，批号:000033-200607);己烯雌酚乳膏及空白基质(批号:20110226，规格:5 mg/25 g，均由东风公司总医院制剂室提供);甲醇(色谱纯);乙醇(分析纯);水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Hypersil ODS C18(150 mm×2.5 mm，5 μm);流动相:甲醇-水(70∶30);检测波长:254 nm;进样量:20 μL。理论板数按己烯雌酚峰计算应不低于2 000。己烯雌酚与其他杂质峰的分离度:大于1.5。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 称取105℃下干燥至恒重的己烯雌酚对照品12.0 mg，精密称定，置于100 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，超声混匀，作为对照品储备液(实配0.127 mg/mL)。

2.2.2 样品溶液的制备 称取己烯雌酚乳膏20.0 g(批号:20110226，含量:0.21 mg/g)，精密称定，置锥形瓶中，加无水乙醇适量，超声处理30 min，放置至室温，残渣用无水乙醇洗涤2～3次，将溶液全部转入100 mL的量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，取续滤液作为样品溶液，备用。

2.2.3 空白样品溶液的制备 取己烯雌酚乳膏基质按“2.2.2”项下样品溶液的制备方法制成空白样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 空白干扰实验 按照上述色谱条件，吸取对照品溶液、样品溶液、空白样品溶液各20 μL分别注入色谱仪，结果空白样品溶液中的组分不干扰样品溶液中己烯雌酚的测定。己烯雌酚峰的保留时间为9.1 min。己烯雌酚峰与其他组分的分离度大于1.5，结果见图1。

2.3.2 标准曲线的绘制 分别精密吸取对照品储备液适量，加无水乙醇稀释成浓度分别为0.012 7、0.038 1、0.063 5、0.088 9、0.114 0 mg/mL的溶液，按“2.1”项色谱条件，分别进样20 μL，记录色谱图。以色谱峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归，得己烯雌酚的回归方程:Y=982.3X+1.733 4， r=0.999 7(n=5)。显示己烯雌酚在0.013～0.114 mg/mL范围内线性关系良好。

图1 己烯雌酚对照品、样品及空白样品色谱图

2.3.3 精密度试验 精密吸取对照品溶液20 μL，重复进样5次，记录色谱图。己烯雌酚峰面积RSD为0.79%(n=5)。

2.3.4 稳定性试验 吸取同一对照品溶液，室温下分别在0、2、4、6、8、12 h进样，记录色谱图。结果己烯雌酚峰面积RSD为0.90%，结果表明，供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.5 重复性试验 称取己烯雌酚乳膏(批号: 110226)，按“2.2.2”项下平行制备5份样品溶液，按“2.1”项色谱条件，依法测定，计算含量，结果己烯雌酚的平均含量为0.21 mg/g，RSD为0.99%，结果显示重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 称取己烯雌酚乳膏10.0 g，精密称定，取对照品溶液 (浓度1.03 mg/mL);分别量取1.5、2.0、2.5 mL至样品中，按“2.2.2”项下样品溶液的制备方法制成混合溶液，依法进样20 μL，记录色谱图。分别平行3次，计算回收率，具体结果见表1。

表1 加样回收率测定结果(n=9)

2.4 样品含量测定 取3批样品，分别按“2.2.2”项下方法操作，进样测定，计算己烯雌酚乳膏中的己烯雌酚含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 本次实验同时选择241、254、260、258、320 nm等6个波长，结果显示，己烯雌酚在254 nm波长时峰形较好，故选择该波长。

表2 样品含量测定结果

3.2 流动相的选择 预实验中曾使用过乙腈-水(用磷酸调至不同pH值)系统作为流动相，在这些系统中己烯雌酚峰形不对称，肩峰，拖尾严重，分离度达不到要求。而采用甲醇-水(70∶30)系统峰形对称，肩峰消失，拖尾因子与分离度均达到要求，稳定性、重现性好。

3.3 样品的前处理 预实验结果显示，在样品溶液制备中，当加入样品量过多时，所得样品溶液呈糊状，加入样品量较少时，理论塔板数较低，影响峰形，取己烯雌酚乳膏(批号为110226)20.0 g所制备的样品溶液较理想。

3.4 己烯雌酚存在顺、反两种异构体，反式体生理活性强，所占比例大，一般制剂多用反式体含量测定代表己烯雌酚含量。在本次实验中，顺式体出峰很小，可忽略，只在注射液中提到顺反势存在动态平衡，己烯雌酚顺式体换算因子为1.26，且不能忽略顺势体的含量。

［1］ 黄芬，叶绍辉，龚振明.己烯雌酚的研究进展［J］.中国畜牧兽医，2007，34(2):51-54.

［2］ 陈新谦，金有豫，汤光.新编药物学［M］.北京:人民卫生出版社，2007:642.

［3］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:38-39，153-156，1029-1031.

［4］ 文远大，马柯，赵士冶.高效液相色谱法测复方己唑乳膏中己烯雌酚，氯霉素，甲硝唑的含量［J］.中南药学，2010，8(11): 832-835.

［5］ 范玉峰，胡守莲.HPLC法测定己烯雌酚软膏中己烯雌酚含量［J］.中国医药导刊，2010，12(6):1093-1094.

［6］ 王静，李军.HPLC法测定己烯雌酚软膏含量［J］.齐鲁药事，2004，23(9):33-34.

［7］ 白林，张艳秀，陆璐.HPLC法测定己烯雌酚乳膏中己烯雌酚和羟苯乙酯的含量［J］.解放军药学学报，2008，24(2):168-170.