β-环糊精包合桂枝、当归混合挥发油的工艺研究

杜帆，夏新华，赵碧清，兰星，朱青

(湖南中医药大学药学院，湖南长沙410208)

桂枝为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl.的嫩枝，性温，味甘、辛，具有发汗解表、温经通阳的功效［1］，含挥发油类成分，其主要成分为桂皮醛、桂皮酸、桂皮醇、香豆素及原儿茶酸等。药理研究表明，桂皮酸具有抗菌、消炎作用，桂皮醛有明显的镇静、镇痛作用［2］。当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥块根，具有活血补血、补气调经等功效［3］，含挥发油达0.42%，油中含藁苯内酯约47%、正丁烯基苯酞11.3%［4］。β-环糊精是由7个葡萄糖分子以1，4-糖苷键连接而成，具有筒状结构，在中药制剂中常用于挥发油的包合，以增加其稳定性，或使其粉末化便于制成适宜的剂型［5］。目前已有桂枝挥发油与当归挥发油的β-环糊精包合工艺研究报道［2-3］，但尚未见有关于桂枝、当归混合挥发油包合工艺的研究报道。作者在对一种用于股骨头坏死的临床经验方进行制剂工艺研究中，采用蒸馏法提取处方中桂枝、当归混合挥发油，为减少挥发油类成分在该制剂生产与贮藏过程中的损失，增加制剂的稳定性，保证制剂的疗效，确定用β-环糊精对桂枝与当归所提混合挥发油进行包合。本实验对桂枝、当归混合挥发油的包合方法、包合工艺条件及包合物进行了较为系统的研究，以期获得其最佳的包合工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器DF—101S集热式温热加热磁力搅拌器(巩义市英屿予华仪器厂);98—1—B电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司);DZF—6050型真空干燥箱(上海惊宏实验设备有限公司);SHZ—D型循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限公司);RE旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。1.2试药药材均购自湖南省医药销售公司，经湖南中医药大学中药鉴定教研室刘塔斯教授鉴定，桂枝为樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl的嫩枝;当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根。β-环糊精(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 挥发油的制备称取一定量的桂枝、当归饮片，加8倍水浸泡0.5 h，按《中国药典》2010年版一部附录挥发油测定法提取［6］，用乙醚萃取提取液两次，加无水硫酸钠脱水［7］，室温下挥干乙醚，得淡黄色的挥发油，密闭保存，备用。

2.2 挥发油包合工艺的研究

2.2.1 包合方法的选择目前应用较多的包合方法是饱和水溶液法和研磨法［8］，故采用这两种方法对桂枝与当归所提混合挥发油进行包合并加以比较。

2.2.1.1 包合物的制备［9-10］

饱和水溶液法:取β-环糊精6 g，置于锥形瓶中，加蒸馏水150 mL，加热溶解，冷却至50℃并于磁力搅拌器上恒温，加入1 mL挥发油(预先配成50%的无水乙醇溶液)，恒温搅拌3 h，冷却至室温，放入冰箱冷藏24 h，抽滤，包合物用石油醚冲洗3次(每次10 mL)，50℃真空干燥4 h，称质量，备用。

研磨法:取β-环糊精6 g，置于研钵中，加3倍量水，研磨均匀。量取挥发油1 mL(预先配成50%的无水乙醇溶液)，缓缓加入研钵中，连续研磨3 h至成糊状，抽滤，包合物再用石油醚冲洗3次(每次10 mL)，50℃真空干燥4 h，称质量，备用。

2.2.1.2 包合物收率及挥发油包合率的测定取收集的干燥包合物，精密称质量，置于挥发油提取器中，按《中国药典》2010年版附录XD挥发油测定法甲法测定其挥发油含有量，按下列公式计算包合物收得率及挥发油包合率［11］。另精密量取混合挥发油1.00 mL，同法进行测定，计算空白回收率(本实验测得回收率为80%)。结果表明，饱和水溶液法的挥发油包合率明显高于研磨法(见表1)。

包合物收得率(%)=［包合物质量/(β-环糊精投入量+挥发油投入量)］×100%

挥发油包合率(%)=［包合物实际收油量/(挥发油的投入量×空白回收率)］×100%

空白回收率(%)=(实际收油量/投入挥发油量)×100%

表1 两种包合方法的比较(n=3)

2.2.2 正交试验优选包合工艺条件

2.2.2.1 实验设计采用正交试验法对饱和水溶液法包合工艺条件进行优选。选择挥发油与β-环糊精的投料比、包合温度、搅拌时间作为考察因素，以挥发油包合率作为评价指标，用L9(34)正交表安排试验。所选因素水平及正交试验安排见表2、表3。

表2 因素水平

2.2.2.2 实验方法与结果依正交试验表(表3)安排的工艺条件，取挥发油与β-环糊精参照上述饱和水溶液法分别制备桂枝与当归混合挥发油的包合物，收集包合物，测定其挥发油包合率，并对数据进行处理与分析。由直观分析可知，各因素作用的主次为A＞C＞B，最佳工艺条件为A2B1C2(见表3)。方差分析表明，A、C二因素对挥发油的包合有显著性影响，B因素的影响不显著(见表4)。因此，可确定最佳包合工艺条件为A2B1C2。

表3 包合工艺正交试验及结果

表4 方差分析

2.2.2.3 验证试验为验证方案A2B1C2的合理性，按照方案A2B1C2的包合工艺条件重复试验3次，其挥发油包合率分别为84.9%、85.1%、85.7%，表明所确定的最佳包合工艺条件A2B1C2合理可行。

2.3 包合物的TLC验证试验

2.3.1 供试品溶液与对照品溶液的制备取当归、桂枝挥发油适量，按照上述最佳包合工艺条件制备包合物。取包合物1 g，共2份，一份加乙酸乙酯5 mL，冷浸1 h，取上清液作为包合物供试品溶液Ⅰ;另一份加蒸馏水20 mL，再加乙酸乙酯5 mL，超声处理30 min，取上层液，加无水硫酸钠脱水，滤过，取续滤液作为包合物供试品溶液Ⅱ。取β-环糊精1 g，按供试品溶液Ⅱ的方法制备阴性对照品溶液。取当归挥发油0.5 mL，置于5 mL量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，摇匀，作为当归挥发油对照品溶液。另取桂皮醛对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为桂皮醛对照品溶液。

2.3.2 包合物中当归挥发油的薄层分析分别吸取当归挥发油对照品溶液2 μL与包合物供试品溶液(Ⅰ、Ⅱ)、阴性对照品溶液各5 μL，点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯(4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置于365 nm紫外光灯下检视［6］。结果显示，供试品溶液Ⅱ在与对照品色谱相应的位置具有相同的蓝色荧光斑点，而供试品溶液Ⅰ与阴性对照品溶液色谱中均未见任何斑点(见图1)，表明当归挥发油进入了β-环糊精分子内部形成了包合物。

图1 当归挥发油TLC图谱

2.3.3 包合物中桂枝挥发油的薄层分析分别吸取桂皮醛对照品溶液2 μL与包合物供试品溶液(Ⅰ、Ⅱ)、阴性对照品溶液各15 μL，点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(17∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以二硝基苯肼乙醇溶液显色［12］。结果显示，供试品溶液Ⅱ在与对照品色谱相应的位置具有相同的颜色的斑点，而供试品溶液Ⅰ与阴性对照品溶液色谱中均未见任何斑点(见图2)，表明桂枝挥发油进入了β－环糊精分子内部形成了包合物。

图2 桂枝挥发油TLC图谱

3 讨论

采用β-环糊精对当归、桂枝混合挥发油进行包合，有利于提高挥发油的稳定性，并可使其由液体变为固体粉末而便于制成固体制剂。本实验比较了两种包合方法对当归、桂枝混合挥发油的包合效果，结果显示饱和水溶液法优于研磨法。在此研究基础上，进一步采用正交试验对饱和水溶液法的包合工艺条件进行优化，得到最佳包合工艺条件为挥发油与β-环糊精的投料比为1∶8、包合温度为40℃、搅拌时间为3 h。该实验结果，可为当归、桂枝相应制剂的生产工艺提供实验依据。

采用TLC法验证当归、桂枝混合挥发油包合物过程中，包合物供试品溶液Ⅰ系以乙酸乙酯冷浸包合物制备而成，由于包合物在乙酸乙酯中不溶，包合到β-环糊精分子内部的挥发油成分不能从包合物中溶出，故其TLC色谱中未检出当归与桂枝挥发油成分，同时也表明包合物的表面没有吸附挥发油。包合物供试品溶液Ⅱ系在包合物中同时加水和乙酸乙酯经超声处理制备而成，由于包合物在水中有一定的溶解性，借助超声波的作用可使挥发油成分从溶解的包合物中释放出来，同时被亲油性较好的乙酸乙酯所萃取，故可从乙酸乙酯萃取液(即供试品溶液Ⅱ)的TLC色谱中检出当归与桂枝挥发油成分。另外，以β-环糊精制成的阴性对照无干扰。因此，通过上述TLC法，可以确认当归、桂枝混合挥发油与β-环糊精形成了包合物。

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