TDM/TDB是结核亚单位疫苗的重要佐剂

孙 蕾 郑锦辉 戚 巍 唐诗邈 综述 郭军巧 审校 (辽宁省疾病预防控制中心，沈阳110005)

结核病是严重危害人类健康的慢性传染病，每年造成全球二百万人死亡[1]，我国结核病患者人数仅次印度，位于世界第二位。我国结核病的耐药状况不容乐观，耐多药结核分枝杆菌的出现给结核病的防治带来巨大的挑战[2]。在多数高负担的发展中国家，由于环境中的细菌长期诱导低水平的抗菌免疫，卡介苗(BCG)缺乏有效性，急需研制有效的结核疫苗控制结核疫情[3]。重组结核蛋白亚单位疫苗Ag85B-ESAT6(H1)正是一种极具前景的新型疫苗。H1是 MTB蛋白Ag85B和ESAT6的融合物[1]，H1有效诱导抗菌免疫需要使用能活化抗原提呈细胞(APC)的佐剂。氧化铝能诱导抗体产生，但对控制细胞内感染的T细胞应答无效。弗氏完全佐剂(CFA)能有效诱导Th1细胞活化，但毒性太大。索因子正6，6-二霉菌酸海藻糖(TDM)及其合成类似物6，6-二十二酸酯海藻糖(TDB)是结核亚单位疫苗的有效佐剂[4，5]，能与重组H1疫苗共同诱导较强的Th1免疫应答。糖脂佐剂TDM/TDB通过活化固有免疫应答启动Th1和Th17免疫机制的研究对于充分发挥疫苗的保护作用具有重要意义。TDM/TDB作用于APC的信号转导途径和发挥免疫刺激活性的分子机制成为疫苗研制的关键。

1 TDM/TDB激活固有免疫程序，活化Th1和Th17细胞功能

哺乳动物免疫包含两个系统，即固有免疫系统和适应性免疫系统。固有免疫作为防御的第一道防线，几分钟内快速发现、识别病原体，未成熟的抗原提呈细胞吞噬、摄取抗原，同时与佐剂的病原体相关分子模式(PAMPs)接触而成熟，进而提呈抗原并活化初始 T细胞，启动抗原特异的获得性免疫应答[6]。

1.1 TDB/TDM有效活化抗原提呈细胞(APCs)佐剂TDB/TDM能有效活化APC，诱导获得性免疫。TDB能上调APC表面MHCⅡ分子和共刺激分子CD40、CD80和CD86的表达，刺激树突状细胞(DCs)和骨髓源巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophage，BMMs)合成细胞因子和一氧化氮(NO)[5]。采用骨髓源巨噬细胞的合成物NO作为细胞活化的标志，TDB/TDM能诱导骨髓源巨噬细胞合成大量NO。与TLR配体CpG对TLR刺激相比，佐剂TDB通过特定的细胞内信号系统活化APCs。TDB选择性诱导基因表达已在蛋白水平被证实，在细胞培养物的上清中能检测到TDB刺激合成的白介素1β(IL-1β)[5]。活化的DC其功能得到增强。

1.2 TDM/TDB促进Th1和Th17细胞合成γ-干扰素和IL-17 为进一步确定TDB佐剂诱导获得性免疫的活性，用H1与TDB刺激淋巴结细胞Th1和Th17细胞应答。TDB诱导强Th1细胞应答，强烈诱导抗原特异性γ-干扰素的合成[7]，也能活化强Th17细胞应答[8]。TDB免疫刺激能力主要依赖其对固有免疫系统的作用[5]。

2 TDM/TDB增强APC功能的分子机制

2.1 TDB/TDM诱导APC活化需要酪氨酸激酶SyK 多种模式识别受体(PRRs)通过不同的信号途径调节髓系细胞活性。多数TLR(Toll-like receptor)通过衔接蛋白MyD88传递信号[9]，免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)相连受体如C型凝集素受体采用激酶Syk作为下游信号。为了解TDB通过哪条信号转导途径活化细胞，采用 MyD88-/-和 Syk-/-BMMs观察TDB对细胞的活化作用。在反应体系中加入TLR受体活化剂后，Syk-/-细胞正常合成NO，MyD88-/-BMMs活化受抑制。相反，TDB/TDM诱导MyD88-/-细胞合成NO不受影响，但不能刺激Syk-/-细胞合成NO。TDB免疫后，MyD88-/-BMMs表达白介素6(IL-6)不受影响，而Syk-/-BMMs不能合成IL-6和IL-1β。小分子Syk抑制剂以剂量依赖的方式阻碍TDB/TDM诱导BMMs合成释放NO[5]。因此，Syk的酶功能对 TDB/TDM 诱导非MyD88-/-依赖固有免疫细胞体外活化是很重要的。

2.2 衔接分子Card9是TDM/TDB发挥佐剂活性的重要分子 TDM/TDB活化巨噬细胞或树突状细胞需要髓系细胞特异衔接蛋白Card9。TDB免疫后，Card9-/-细胞不能合成NO和上调诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、IL-6和IL-1β的表达。而CpG刺激Card9-/-细胞后，这些分子的表达在很大程度上不受影响。凝胶多糖(Curdlan)是C型凝集素受体Dectin-1的配体，由Card9传递信号。TDB和Curdlan刺激DCs合成IL-12p40、IL-12p70和 IL-12p23依赖于 Card9。在Card9缺乏的条件下，TDB和Curdlan诱导细胞活化的能力完全丧失，而CpG活化基因表达的能力不受影响。通过分析 DCs分泌 IL-1β、IL-6和 TNF-α发现，TDB严格地以Card9依赖的方式激发核转录因子NF-κB的核移位[5]，Card9与下游衔接分子和支架蛋白BCL10和 Malt1结合，促进 NF-κB活化，诱导巨噬细胞分泌细胞因子[10]。因此，上述实验证明TDB、TDM在基因转录水平上调节固有免疫，这一途径依赖Syk激酶活化和衔接蛋白Card9、Bcl10和Malt1。

2.3 TDB/TDM需要ITAM受体-衔接蛋白FcRr识别 TDB/TDM不依赖Dectin-1受体激活APC，但需要ITAM受体-衔接蛋白FcRr识别。用Curdlan不能刺激 Dectin-1-/-BMMs合成 NO，但 TDB、TDM、CpG和LPS不受影响，因此，TDB/TDM不依赖Dectin-1受体激活APC。活化Syk的髓系细胞受体与衔接蛋白Dap12或FcRr之一有关[9]。为进一步了解TDB/TDM活化 APC所需的信号分子，使用Dap12-/-BMMs和 FcRr-/-BMMs。TDB/TDM 刺激后，FcRr-/-BMMs表达的一氧化氮合酶2(Nitric oxide synthase2，NOS2)和合成的NO特异丧失，TDB/TDM诱导 NOS2的表达不依赖于 Dap12。TDB/TDM诱导大量的IL-6表达特异需要FcRr。因此，ITAM受体相关衔接蛋白FcRr对于TDB/TDM识别Syk-Card9信号途径是至关重要的[5]。

2.4 TDB/TDM与ITAM受体的特异结合 目前，特异识别TDB/TDM的受体已被查明，一些C型凝集素受体(Mincle、Dectin-2和 DCAR)，还有其它FcRr偶联蛋白(OSCAR和PIRA)被认为是候选受体[7]。其中，Mincle-Fc融合蛋白成剂量依赖的与TDM和TDB特异结合，说明细菌来源的糖脂TDM和TDB是Mincle受体的配体[11]。TDM由一个海藻糖和两个霉菌酸链组成。两者均不能单独激活表达Mincle受体的细胞，这表明TDM的糖脂结合对于TDM与Mincle受体相互作用起到关键作用。TDM/TDB能上调C型凝集素受体Mincle在巨噬细胞中的表达，用定量RT-PCR检测Mincle mRNA发现，TDM/TDB诱导的Mincle上调完全依赖于FcRr和Card9。Mincle受体识别结核分枝杆菌(MTB)的活性需要受体中糖类识别区域的EPN基序[12]。细菌索因子TDM或合成类似物TDB与Mincle受体结合，巨噬细胞表面的Mincle受体交联，活化Mincle-FcRγ复合体，因此，与FcRr相结合的Mincle受体与糖脂TDB和TDM结合是激活巨噬细胞的必要条件，也是TDB和TDM发挥佐剂活性的关键。

总之，糖脂佐剂TDM和TDB与含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的受体结合，ITAM受体-衔接蛋白FcRr复合体活化，由FcRγ传递激活信号，通过Syk-Card9-Bcl10-Malt信号途径将膜受体活性转换为下游信号，促进NF-κB活化，通过胞质的信号级联反应途径激活APC。FcRr相结合的ITAM受体与糖脂TDB和TDM结合是激活APC的必要条件，也是TDB和TDM发挥佐剂活性的关键。

3 衔接分子Card9是TDB/TDM发挥佐剂活性的关键

为了解Card9是否为亚单位疫苗H1和TDB诱导免疫保护所必需，用低剂量的MTB气溶胶感染小鼠，6周后检测肺组织中细菌量。含H1和TDB脂粒的疫苗可以使感染鼠肺部细菌的量明显减少，而单独H1脂粒疫苗没有明显效果。与对照相比，TDB和H1免疫不能减少Card9-/-鼠肺部细菌的集落数。证明在体内Card9在TDB诱导的抗结核免疫中发挥重要作用，这种保护作用与Card9依赖的抗原特异Th17细胞活化有关，与H1特异的合成γ-干扰素的CD4+T细胞数量的增加无关[5]。

Card9-/-鼠选择性的髓系细胞缺陷，淋巴细胞活性不受影响。在脂粒中仅加入H1疫苗注射后，对照鼠和Card9-/-鼠均出现短暂的脚掌肿胀。用含有H1疫苗和TDB/TDM的脂粒注射后，对照鼠脚掌迅速变厚，而Card9-/-鼠无变化。TDM或TDB诱导Card9-/-鼠淋巴细胞合成γ-干扰素的能力减弱，暗示 TDB/TDM诱导 Th1细胞分化依赖于Card9。TDB/TDM诱导Card9-/-鼠淋巴细胞合成H1特异的IL-17的能力完全缺失，表明Card9在TDM/TDB诱导 Th17细胞分化中起关键作用[5]。因此，Card9是体内TDB和TDM发挥佐剂活性必需的。

4 结语与展望

佐剂是绝大多数疫苗的组成成分，并发挥重要的免疫调节作用。细菌索因子TDM和其类似物TDB能活化固有免疫细胞，诱导适合的、保护性的Th1和Th17反应。用含佐剂TDM的亚单位疫苗免疫后，诱导的Th17细胞水平与MTB刺激机体产生的免疫程度相一致。

佐剂TDM/TDB与抗原提呈细胞(APC)表面受体相结合，通过细胞内信号转导途径活化APC，分泌IL-1β、IL-6和IL-23等细胞因子，这些细胞因子作为细胞免疫应答的第三信号共同诱导Th17分化[13，14]。TDM 和 TDB 通过 Syk-Card9 信号调节免疫保护机制是发展有效TB免疫战略的基础。对TDM、TDB佐剂活化固有免疫细胞分子机制及信号传导途径的研究使通过特异抗体调节疫苗反应成为可能，对充分发挥疫苗功能和控制结核具有重要意义。

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