生物传感器在真菌毒素检测中的应用

孙永明 陈建红 钱跟林 杨敦祥 陆 瑾

（1.江苏省吴江市畜牧兽医站，吴江 215200；2.南京农业大学，南京 210095）

生物传感器是将生物技术和电子技术相结合，以生物学组件作为主要功能性元件，能够感受规定的被检测物质的量，并按照一定规律将其转换成可识别信号的器件或装置。它一般由生物识别元件、转换元件、机械元件和电气元件所组成[1]。生物传感器根据分子识别元件与待测物结合的性质可分为：（1）利用酶的专一性和催化性的催化型生物传感器（酶传感器和微生物传感器等）；（2）利用分子间特异亲和性的亲和型生物传感器（免疫传感器和DNA传感器等）。利用换能器的性质，可将生物传感器分为：电化学生物传感器、压电晶体生物传感器和光纤生物感器等[2]。其中，上述许多产品具有实用开发价值。

毒素（toxin）是由生物体产生的，其极少量即可引起动物中毒。按来源可分为动物毒素、植物毒素和微生物毒素。其中，微生物毒素包括真菌毒素和单细胞藻类（如原核的蓝藻和真核的甲藻）毒素等[3]。毒素对食品生产各个环节的危害性很大，2011年我国发生的黄曲霉毒素污染食用油和牛奶的事件在全国引起了很大反响。因此，加强对其检测至关重要。本文就生物传感器在几种常见真菌毒素的检测中的应用状况及应用前景进行概述。

1 生物传感器的研究现状

目前，生物传感器应用较多的领域是在医疗、医药、生物工程、环境保护、食品、农业、畜牧等与生命科学关系密切的一些领域。例如，临床上用免疫传感器等生物传感器来检测体液中的各种化学成分，为医生的诊断提供依据；生物工程产业中用生物传感器监测生物反应器内各种物理、化学、生物的参数变化以便加以控制；环境监测中用生物传感器监测大气和水中各种污染物质含量，食品行业中用生物传感器检测食品中营养成分和有害成分的含量、食品的新鲜程度等[4]。

早在1979年，Matssunage等开发了非染料偶合的燃料电池型微生物电极系统，检测范围107～109cfu/ml。1982年，Nishikawa等以2，6-二氯酚靛酚为媒介，并用滤膜预富集制成的生物传感器对细菌的检测极限可达104cfu/ml。1989年，Muramatsu等用一个压电晶体传感器系统测定病原微生物（Canolidaalbicans），测定范围106～108cfu/ml。Cao等在1995年应用光纤传感器检测分析血清、全血、血浆中的鼠疫耶尔森氏菌F1抗原；Rowe-Taitt等在2 000年使用光纤传感器检测了炭疽杆菌、土拉弗氏菌等；Anderson等应用光纤传感器RAPTOR，先后检测了鼠疫杆菌F1抗原、葡萄球菌肠毒素、蓖麻毒素、炭疽芽孢、土拉弗氏菌等[2-3]。2004年在西班牙格拉纳达会展中心召开的第八届世界生物传感器大会对9个专题进行了分组讨论。包括核酸传感器和DNA芯片、免疫传感器、酶传感器、组织和全细胞传感器、用于生物传感器的天然与合成受体、新的信号转导技术、系统整合/蛋白质组学/单细胞分析、生物电化学/生物燃料/微分析系统、商业发展和市场[5-7]。其中，单分子/细胞分析和生物印迹生物传感器由于它们良好的发展态势及在生命科学研究中的重要位置成为与会学者讨论的热点问题[8-10]。

2 生物传感器在真菌毒素检测中的应用

真菌毒素是真菌分泌产生的有毒代谢产物。常见污染食品的真菌毒素主要有黄曲霉毒素、赭毒素、杂色曲霉素、T-2毒素、伏马素、镰刀菌稀醇类毒素、展青霉素和橘霉素等。检测食品中污染真菌毒素的方法主要有薄层层析法和液相色谱法等[11]。近20多年来，医学方法在真菌毒素的检测中得到了较好的应用，以此为基础的免疫生物传感器快速检测真菌毒素的方法也有研究报道和应用，其中以免疫传感器用于检测黄曲霉毒素B1和伏马素B1的研究报道为最多[12]。此外，也有运用微生物传感器和以纤毛虫微生物敏感材料的传感器检测展青霉素、黄曲霉毒素B1和T-2毒素的研究报道[13]。

2.1 黄曲霉毒素B1

黄曲霉毒素B1（AflatoxinB1，AFB1）是目前所发现的毒性最强的真菌毒素，能引起人类（尤其是儿童）以及各种动物的急性中毒和死亡，被国际癌症研究中心（ICRC）定为是人类的致癌剂。通过光纤免疫传感器来测定花生和玉米抽提物，可测得0.05ng/ml的AFB1

[14-15]。Stracha等人用一种传感器来检测食物中的AFB1，灵敏度也很高，可达4ng/ml，分析时间只用了8min，而且特异性强[16]。Carter等人利用光纤免疫传感器来测定花生和玉米抽提物中的AFB1，检测限可达0.05ng/ml[17]。

2.2 杂色曲霉素

杂色曲霉素（Sterigm atocystin，ST），是黄曲霉毒素合成途径的前体（sterigm atocystin（ST）-O-m ethylsterigm atocystin（OM ST）-AFB1）。但杂色曲霉素由于污染含量高，危害性高于黄曲霉毒素[42]。

将黄曲霉毒素氧化酶（AFO）固定在壳聚糖（CS）-单壁碳纳米管（SWCNTs）杂交膜中，组装在聚邻苯二胺（POPD）修饰的金电极（Au）表面，制备了对杂色曲霉素（ST）敏感的生物传感器（AFO/CS-SWCNTs/POPD/Au）。运用原子力显微镜（AFM）、傅立叶变换红外光谱（FT-IR）和交流阻抗技术（EIS）对电极组装过程进行了表征。循环伏安法研究表明，AFO在修饰电极上发生了准可逆的氧化还原反应，是表面控制过程，其式量电位为0.436 V（vs.Ag/AgCl），说明包埋在CS-SWCNTs中的AFO和电极之间发生了直接电子传递。AFO修饰电极对ST具有明显的电催化作用，其表观米氏常数appMK为7.13μmol/ml，催化电流与ST浓度在10～310 ng/ml范围内呈线性关系，相关系数为0.997，检出限为3 ng/ml（S/N=3），响应时间小于10s。组装的生物传感器具有较好的稳定性与重现性，连续检测20 ng/ml的ST标准溶液11次，电流值RSD为3.9%；放置1个月后，其电流响应值仍为初始值的85.6%[19-20]。

该方法具有较高的选择性和灵敏度，应用于实际样品检测时，其回收率在87.6%～105.5%之间[19-20]。建立的ST含量的电化学测定方法简便快捷，测定结果令人满意。

2.3 伏马菌素B1

伏马菌素B1（Fum onisinsB1，FB1）是天然污染玉米食品和饲料的主要毒素组分，与马脑白质软化症、猪的肺水肿症和人类食道癌等人、畜疾病有关。Wayne等人[21]用表面等离子体振子共振免疫传感器来检测玉米抽提物中的FB1浓度，可达到检测下限为50ng/ml，分析时间为10min；Thamlpson[22]等人用光纤免疫传感器来检测FB1，可测得下限为10ng/ml，响应时间提高到4min。微生物传感器[23]对几种突变物AF-2、丝裂霉素、克菌丹、黄曲霉素B1、硝基胍的检出限分别为1.6，0.5，0.9，0.8μg/m L，比采用Am es等方法不仅时间短（前者60min，后者少则2-3d，长则7d），灵敏度也高（前者对AF-2的最低限为1.6μg/ml，后者为10μg/ml）。

该传感器工作菌株为枯草杆菌，已知该菌株野生型（Rec+）的DNA在受到化学损伤后能通过分子重组而得到修复，故能继续繁殖；而丧失这种自我修复能力的缺陷型菌（Rec-）在DNA受到化学损伤后，因失去繁殖能力而死亡。将Rec+和Rec-菌株分别固定在一对氧电极表面，即构成致突变传感器[24]。

3 生物传感器的应用前景

生物传感器的问世极大地简化了微生物毒素的分析方法，不仅减少了分析时间，提高了灵敏度，使测定过程变得更为简单，而且便于实现自动化，使微生物毒素的现场检测成为可能。尽管现在生物传感器的应用受到其稳定性、重现性和使用寿命等诸多限制，再加上待测物成分多且含量差异大、抗体种类少和不稳定等问题，许多生物传感器的研究还处在实验阶段，实际应用时环境和样品的复杂性成为制造此类传感器的主要障碍，限制了实现商业化的生物传感器的数量。但是，由于生物传感器具有高选择性、响应快，操作简单、携带方便和适合于现场检测等优点，所以仍是目前重点研究的对象。

对生物传感器检测微生物毒素的研究是各国科学家积极探索的课题，这些制约条件也是各国科学家致力于解决的问题。随着计算机技术、材料技术、生物技术等的发展，生物传感器现存的诸多不足将有望得到完善，在微生物毒素检测中的应用将越来越广泛，并且在现场检测方面无疑将会发挥更大的作用。生物传感器在微生物毒素检测中的发展方向，主要是进一步拓宽应用范围；由单一功能向多功能发展；与其他仪器集成，以提高灵敏度和分析速度，实现准确、快速检测；向便携式，操作简便、低成本，商业化、产业化方向发展。

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