华法林个体化用药的研究进展

葛蓓蕾 田陆云 王 红 (昆明医科大学第一附属医院，云南 昆明 650032)

华法林(warfarin)是20世纪40年代合成的香豆素类口服抗凝血药，目前被广泛应用于多种疾病的抗凝治疗，如瓣膜病、瓣膜置换、非瓣膜病性房颤、电复律、冠心病、肺栓塞和深静脉血栓形成等〔1〕。但华法林治疗范围窄，临床疗效和不良反应个体差异很大，剂量很难掌握，即使很小的剂量也可能会导致出血，抗凝不足又会导致血栓的形成。因而限制了其在临床上的应用。近年来随着分子生物学领域的快速发展，基因多态性的研究给华法林临床个体化用药带来希望。

目前对华法林个体剂量差异相关基因的研究大致从以下两类着手:一类是影响药物代谢动力学，编码药物代谢酶和负责转运的基因，如细胞色素氧化酶P450(CYP)、有机阴离子转运子等;一类是影响药物效应动力学，编码药物作用的靶点、血浆转运蛋白等的基因，如 VKORC1、载脂蛋白E、γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)、微粒体环氧化物水解酶(mEH)等。

1 华法林的药物代谢

华法林在体内是被不同的CYP同工酶通过羧基化而代谢成非活性产物的。临床上所用的华法林制剂为消旋混合物，为S-华法林对映体和R-华法林对映体混合物。不同类型的华法林对映体代谢酶、代谢产物也不同。S-华法林对映体经CYP2C9酶催化生成无活性6-7羟华法林;而R-华法林对映体则由 CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4 酶代谢〔2〕。其中 CYP3A4 将R-华法林催化生成无10-羟华法林，此为R-华法林代谢的主要成分。S-华法林其抗凝活性是R-华法林的3～5倍〔3〕。由此可以看出CYP2C9是影响华法林代谢的主要酶之一。

1.1 CYP2C9多态性及等位基因的突变频率 细胞色素P450(CYP450)是参与许多内外源性物质代谢的单加氧酶，位于细胞内质网膜上，由 CYP基因超家族编码。最大的家族是CYP2〔4〕，目 前 已 经 分 离 出 CYP2C8、CYP2C9、CYP2C10、CYP2C17、CYP2C18及CYP2C19。其中CYP2C9基因编码的蛋白在人肝微粒体中含量丰富，约占CYP450总量的20%，仅次于CYP3A，催化了约16%〔5〕的临床常用药物。

大量研究表明CYP2C9在人类存在几种等位基因突变体，其中最主要的有3种:野生型 CYP2C9*1、CYP2C9*2和CYP2C9*3。突变体是CYP2C9*2和CYP2C9*3，其编码的酶活性比野生型CYP2C9*1降低了30%和80%〔6〕，CYP活性降低的患者，华法林在体内代谢速度减慢，导致有效血药浓度升高，进而使药物疗效增强。因此CYP2C9基因突变体需要华法林剂量较低。携带这两个等位基因的个体服用华法林后需要较长的时间才能达到稳态血药浓度，并且在使用初期出血危险性较高。CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因频率有较大的种族差异。白种人中突变发生率高于黄种人和黑人，在白种人中CYP2C9*2型突变率在10%以上，意大利人达到12.5%，亚洲人中这种突变率非常低。CYP2C9*3型突变在白种人中发生率在7.5% ～10%，亚洲人中约 3%〔7〕。其他突变如:CYP2C9*4，CYP2C9*5，CYP2C9*6 以及 CYP2C9*11等在人群中突变频率很低，华法林剂量的影响还有待于研究〔8〕。

1.2 CYP2C9 多态性与华法林剂量 Kamali等〔9〕报道CYP2C9基因多态性会影响华法林的剂量，如纯合子(*1/*1，n=74)所需剂量为(4.06±1.72)mg，杂合子(*1/*2，n=30)为(3.63±1.78)mg，杂合子 (*1/*3，n=15)为(2.70±1.36)mg。Sanderson等〔10〕在 CYP2C9 与华法林多态性的研究中指出有20%的病人有等位基因变异，CYP2C9*2型平均日华法林剂量减少了0.85 mg，CYP2C9*3型减少了1.92 mg，CYP2C9的基因型在华法林的临床应用中有很大的意义。中国人华法林代谢主要与CYP2C9*1和CYP2C9*3有关，马量等〔11〕报道CYP2C9.Leu359基因变异与华法林并发症的关系。报道表明CYP2C911e.359 Leu 359的突变会减慢S-华法林的代谢，携带该突变的病人容易出现出血等并发症，此类病人应用华法林的剂量要小。华人华法林维持剂量比印度人低，在印度的华人，除CYP2C9*3突变体外，还发现了更多的变异，如在CYP2C9启动子、外显子、内含子也发现了突变〔12〕。

2 华法林的作用机制

华法林通过抑制维生素K环氧化物还原酶，阻止维生素 K还原形式(KH2)的形成。KH2通过对维生素K依赖性凝血因子 Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ氨基末端谷氨酸残基的γ-羧化作用，使其具有生物活性。在羧化形成过程中，耦联氢醌型维生素K被氧化成环氧型维生素K。使维生素K依赖性凝血因子前体被持续羧化成有活性的凝血因子。体内环氧型维生素K还原为氢醌型维生素K由维生素环氧化物还原酶复合体(VKORC)完成，VKORC是维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶〔13〕，同时VKORC由VKORC1激活。VKORC1不但主导维生素K依赖性凝血因子的生成，而且是香豆素类抗凝药物华法林的作用靶点〔14〕。目前，对华法林作用机制影响的基因研究热点集中在VKORC1。

2.1 VKORC1基因多态性与等位基因频率 VKORC1位于16号染色体上，其产物维生素K环氧化物还原酶亚单位1，位于内质网膜上。很多研究显示VKORC1基因多态性比CYP2C9基因多态性更能显示华法林个体剂量差异，它不但可以解释华法林的个体差异还可以解释种族差异。目前对VKORC1多态性的研究集中在启动子-1639A/G，内含子1173C＞T和3'非编码区的3730G＞A。

台湾学者Yuan等〔14〕一项研究发现，启动子区-1639A＞G多态性与华法林剂量有关。AA，AG，GG3种基因型在中国患者中的分布频率分别为:79.7%、17.6%及2.7%，对华法林敏感的均为-1639AA基因型，对华法林抵抗的与-1639GG和GA基因型相关。而在白种人中分别为:14%、47%及39%。这两种人种中AA基因型频率的差异与临床上发现的华法林维持剂量差异相一致。Lee研究〔15〕指出，在中国，马来西亚和印度人中华法林需求剂量的不同可以用民族间VKORC1基因型的不同来解释。VKORC1基因序列上存在10种基因突变，据此命名为H1～H9的单倍体模型，发现H1突变与华法林剂量减少有关，而H7、H8、H9突变与华法林剂量增加有关。H1突变在中国人、马来西亚人分别占87%、65%，在印度人中占12%。H7、H8、H9突变在中国人、马来西亚人分别占9%和30%，而印度人占82%，这三者和华法林的剂量差异相符。

2.2 VKORC1基因多态性与华法林剂量 D'Andrea等〔16〕提出两个常见的多态现象，即位于内含子1的1173C＞T和3'非编码区的3730G＞A能影响华法林个体剂量。在不考虑其他变异存在的情况下，1173CC基因型华法林剂量(6.2 mg/d)比CT或者TT基因型(4.8 mg/d)高。同时研究也发现位于内含子区的1173C＞T的突变与VKORC1-1639A/G突变存在着强烈的连锁不平衡效应，对华法林敏感的-1639AA基因型同时也是1173TT纯合子的基因型，对华法林抵抗的-1639AG同时也是1173TC基因型，-1639GG也与1173CC连锁。1639G＞A启动子还与 6484C＞T(rs9934438)，6853G＞C(rs8050894)和7566C＞T(rS2359612)有很明显的连锁不平衡〔17〕。

台湾学者Yuan等〔14〕的研究显示在要达到相同抗凝强度时，华法林剂量也就随着基因型的不同而出现了差异，-1639AA基因型对华法林敏感，华法林需求剂量≤1.5 mg/d，而-1639AG或者-1639GG对华法林抵抗，华法林需求剂量≥6.0 mg/d。他们推断这是由于VKORC1-1639A/G变异导致该启动子活性不同，VKORC1 mRNA表达量不同，引起VKORC1蛋白量不同，进而导致华法林个体剂量差异。

3 其他多态性与华法林剂量之间的关系

载脂蛋白E(ApoE)基因共有4个外显子，其产物主要在肝脏和小肠合成。ApoE存在于乳糜微粒残粒中，并在其代谢过程中作为受体与配体结合，协助VitK转运至肝脏〔18〕。ApoE最主要的3个表型E2、E3和E4相对应的是4号外显子的3种基因型，分别为2、3、4。不同的等位基因变异对华法林剂量的影响取决于它们在这个人群中的突变频率，这受种族的影响。例如ε4基因型对华法林需求剂量影响很小，临床相关性小，在亚洲人群中其基因型频率比高加索人和美国人要低〔19〕。多变量回归分析显示在抗凝治疗人群中，病人的年龄、体重、CYP2C9、VKORC1、APOE基因的多态性可以显著预测华法林剂量(R=57%)。但是ε4基因仅能解释2%华法林个体剂量差异。

γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)基因有15个外显子，其基因产物GGCX蛋白是一种微粒体膜酶，存在于粗面内质网和高尔基体上。GGCX催化VitK依赖的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ，以及蛋白C和S的谷氨酸残基翻译后的γ-羧化，此羧化过程与随后进行的还原型VitK氧化过程相耦联，氧化型VitK又被VKORC1所还原。Wadelius等〔20〕研究了GGCX基因的14个单核苷酸多态性(SNP)，发现位于2号内含子的SNP与华法林的剂量密切相关，其他单倍型与华法林的剂量无明显相关性。另外有研究显示〔21〕，VKORC1基因多态性显著影响华法林个体剂量，CYP2C9*3、*2中等程度的影响华法林个体剂量。其他基因无影响或仅有很小的影响，这些基因包括编码GGCX，各种凝血因子、环氧化物水解酶(mEH)、CYP的各种亚型，某些谷胱甘肽转移酶、APOE、蛋白C。至于CYP4F2，意义很小，CYP4F2突变的病人华法林剂量约增加0.5 mg/d。作者指出除了CYP2C9和VKORC1，其他常见的单核苷酸基因多态性很少影响华法林的个体剂量。因此有关此两个基因有待进一步研究。

4 基因型和抗凝反应之间的联系

华法林的代谢受很多病理、生理和环境因素的影响，但多项研究显示:遗传因素在华法林个体反应差异中起决定性的作用。华法林在起始治疗时常会出现过度抗凝，尤其是老年人，随着年龄的增长，肝脏合成凝血因子能力减退，VitK的摄入与吸收减少;CyP450酶含量及活性下降;同时由于并存疾病及合并用药，出血倾向明显，华法林的剂量应相应减少。一项研究表明〔22〕携带CYP2C9突变体的病人，INR值高于治疗范围的比率较高，需要较长的时间才能达到维持剂量，危及生命的出血风险率较野生型高。另一项研究证明〔23〕，CYP2C9*2或者CYP2C9*3杂合子和纯合子与野生型相比华法林剂量低，过度抗凝导致出血的风险率增加。由此我们认识到基因型与严重出血有关，我们应关注基因型和其他因素对华法林个体差异的影响，从而进行更有针对性的个体化治疗。

Sconce等〔24〕通过对年龄、体重、CYP2C9 和 VKORC1基因型变量进行分析，可以解释55%华法林需求剂量的差异。一项瑞典人的研究显示〔25〕，在起始治疗时，纯合子的 CYP2C9和VKORC1等位基因突变会增加过度抗凝的风险。CYP2C9、VKORC1、年龄、性别、药物间相互作用的多重回归分析可以解释59%的华法林个体剂量差异。非遗传因素可以解释17%～22%的剂量差异。CYP2C99，VKORC1 CC，VKORC1 TC联合年龄体重可以解释亚洲人60.2%的华法林剂量差异〔26〕。

华法林的临床个体用药差异是由多种因素决定的，除了基因影响华法林剂量差异外，环境、饮食也是华法林个体剂量差异的因素。尽管CYP2C9、VKORC1、临床和病人因素不能完全解释华法林剂量需求的个体差异，但很多研究显示通过CYP2C9、VKORC1基因型剂量方程的建立仍然可以提高华法林剂量的准确性，减少经验性用药所带来抗凝不足或过度抗凝的风险，提高个体抗凝治疗安全性。未来遗传药理学的临床应用要求药物剂量与遗传学、临床和病人因素结合起来，以更好地指导个体化用药，从而使临床用药更具针对性、高效性和安全性。

1 许俊堂，胡大一.华法林的临床应用〔J〕.中国医刊，2004;39(1):43-6.

2 Redman AR.Implications of cytochrome P4502C9 Polymorphism on warfarin in metabolism and dosing〔J〕.Pharmacotherapy，2001;21(2):235-42.

3 You Jh，Zuo Z，Loem，et al.Any effect of CYP2C9 variants on warfarin clearance in Chinese Patients〔J〕.Thromb Haemost，2007;97(5):866-8.

4 Yasar U，Lundgren S，Eliasson E，et al.Linkage between the CYP2C8 and CYP2C9 genetic polymorphisms〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2002;299(1):25-8.

5 Schwarz UI.Clinical relevance of genetic polymorphisms in the human CYP2C9 gene〔J〕.Eur J Clin Invest，2003;33(Suppl 2):23-30.

6 Higashi MK，Veenstra DL，KondoL M，et al.Association between CYP2C9 genetic variants and anticoagulation related outcomes during Warfarin therapy〔J〕.JAMA，2002;287(13):1690-8.

7 陈晓晖，赵树进，袁 进.CYP2C9基因多态性与药物代谢及疾病关系研究进展〔J〕.药物流行病学杂志，2005;14(2):178-80.

8 Tai G，Farin F，Rieder M J，et al.In-vivo effects of the CYP2C9*1 Polymorphism on warfarin metabolism and dose〔J〕.Pharmacogenet Genomics，2005;15(7):475-81.

9 Kamali F，Khan TI，King BP，et al.Contribution of age，body size，and CYP2C9 genotype to anticoagulant response to warfarin〔J〕.Clin Pharmacol Ther，2004;75(3):204-12.

10 Sanderson S，Emery J，Higgins J.CYP2C9 gene variants，drug dose，and bleeding risk in warfarin-treated patients:A Hu GEnet(tm)systematic review and meta-analysis〔J〕.Genet Med，2005;7:98-104.

11 马 量，余国伟，叶丁生，等.细胞色素 P4502C9-leu359基因变异与华法林抗凝治疗研究〔J〕.心脑血管病防治，2001;1(2):21-3.

12 Zhao F，Loke C，Rankin SC，et al.Novel CYP2C9 genetic variants in A-sian subjects and their influence on maintenance warfarin dose〔J〕.Clin Pharmacol Ther，2004;76(3):210-9.

13 Goodstadt L，Ponting CP.Vitamin K epoxide reductase:homology，active site and catalytic mechanism〔J〕.Trends Biochem Sci，2004;29(6):289-92.

14 Yuan HY，Chen JJ，Lee MT，et al.A novel functional VKORC1 promoter polymorphism is associated with interindividual and interethnic differences in warfarin sensitivity〔J〕.Hum Mol Genet，2005;14(13):1745-51.

15 Lee SC，Ng SS，Oldenburg J，et al.Interethnic variability of warfarin maintenance requirement is explained by VKORCI genotype in an Asian population〔J〕.Clin Pharmacol Ther，2006;79(3):197-205.

16 D'Andrea G，D'Ambrosio RL，Di Perna P，et al.A polymorphism in the VKORC1 gene is associated with an interindividual variability in the dose-anticoagulant effect of warfarin〔J〕.Blood，2005;105(2):645-9.

17 Geisen C，Watzka M，Sittinger K，et al.VKORCl haplotypes and their impact on the interindividual and interethnic variability of oral antieoagulation〔J〕.Thromb Haemost，2005;94:773-9.

18 Mahley RW.Apolipoprotein E:cholesterol transport protein with expanding role in cell biology〔J〕.Science，1998;240(4852):622-30.

19 Lai S，Sandanaraj E，Jada SR，et al.Influence of APOE genotypes and VKORC1 haplotypes on warfarin dose requirements〔J〕.Br J Clin Pharmacol，2008;65:260-4.

20 Wadelius M，Chen LY，Downes K，et al.Common VKORCI and GGCX polymorphisms associated with warfarin dose〔J〕.Pharmacogenomics J，2005;5(4):262-70.

21 Cooper GM，Johnson JA，Langaee TY，et al.A genome-wide scan for common variants with a large influence on warfarin maintenance dose〔J〕.Blood，2008;112:1022-27.

22 Higashi MK，Veenstra DL，Kondo LM，et al.Association between CYP2C9 genetic variants and anticoagulation-related outcomes during warfarin therapy〔J〕.JAMA，2002;287:1690-98.

23 Joffe HV，Xu R，Johnson FB，et al.Warfarin dosing and cytochrome P450 2C9 polymorphisms〔J〕.Thromb Haemost，2004;91:1123-8.

24 Sconce EA，Khan TI，Wynne HA，et al.The impact of CYP2C9 and VKORC1 genetic polymorphism and patient characteristics upon warfarin dose requirements:proposal for a new dosing regimen〔J〕.Blood，2005;106:2329-33.

25 Gauge BF，Eby C，Johnson JA，et al.Use of pharmacogenetic and clini-cal factors to predict the therapeutic dose of warfarin〔J〕.Clin Pharmacol Thera，2008;84:326-31.

26 Tham LS，Goh BC，Nafziger A，et al.A warfarin-dosing model in Asians that uses single-nucleotide polymorphisms in vitamin K epoxide reductase complex and cytochrome P450 2C9〔J〕.Clin Pharmacol Thera，2006;80:346-55.