纳米粒子对免疫系统影响的研究进展

王 晶，洪 铁，张英鸽

(1.军事医学科学院毒物药物研究所纳米药理毒理重点实验室，北京 100850;2.吉林大学药学院药理学教研室，吉林长春 130021)

纳米粒子是指尺度在1～100 nm之间的微粒[1]，这类粒子具有表面效应、小尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应等纳米特性。应用纳米粒子的某些特殊性质，将其应用于医药领域，可作为疫苗佐剂以增强抗原免疫原性及作为药物载体提高药物治疗的靶向性。纳米粒子具有淋巴靶向性[2]，易在淋巴系统分布和存留。淋巴系统作为机体的免疫系统，对于机体抵御外来侵害具有重要作用。因此，研究纳米粒子对免疫系统的影响具有重要意义。

1 对固有免疫系统的影响

固有免疫系统又称非特异性免疫系统，是免疫防御的第一道防线。纳米粒子通过以下方式对固有免疫系统产生影响:①影响免疫细胞的活性;②非特异性地增强或减弱免疫反应，参与免疫调节;③激活补体系统。

纳米粒子能够影响固有免疫细胞的活性及免疫系统免疫分子的分泌。Morimoto等[3]在对呋仑碳纳米粒子的研究中发现，在大鼠气管内滴注呋仑碳1 mg能够导致中性粒细胞及中性粒细胞趋化因子1(neutrophil chemotactic factor-1，NCF-1)，NCF-2αβ和NCF-3出现短暂的显著增加。Simeonova等[4]发现，结合了表柔比星(表阿霉素，epirubicin)的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒子能抑制自然杀伤细胞(NK)的活性，而不结合表柔比星或与表柔比星简单混合的对照样品则会增强NK细胞的活性。此外，Jovanovic等[5]用黑头呆鱼研究纳米尺寸的TiO2(＜100 nm)对中性粒细胞功能和免疫基因表达的影响，通过考察突发性氧化作用、去甲肾上腺素转运蛋白(norepinephrine transporter，NET)释放和原发颗粒(primary granule)脱颗粒研究TiO2纳米粒子对中性粒细胞的作用，通过实时荧光定量核酸扩增检测系统对固有免疫系统相关调控基因的表达进行测定。结果发现，TiO2纳米粒子0.1 mg·L-1在体外能够刺激产生突发性氧化作用和NET释放，腹膜内注射TiO2纳米粒子10 mg·kg-1引起突发性氧化作用、NET释放和脱颗粒显著下降。黑头呆鱼暴露在TiO2纳米粒子中 48 h，体内白细胞介素 11(interleukin-11，IL-11)、巨噬细胞刺激因子1和中性粒细胞胞浆因子2表达水平显著升高，从而表明TiO2纳米粒子具有干扰固有免疫系统免疫应答的潜能，引起IL-11、巨噬细胞刺激因子1和中性粒细胞胞浆因子2的基因水平上调。

巨噬细胞是机体的监视细胞，能够监视进入机体的外来物质[6-7]，并在清除抗原和调节机体免疫反应方面起着重要的作用[8]。体外实验结果表明，纳米粒子能够进入巨噬细胞[9]，并引起氧化应激和线粒体损伤[10]。一些体内研究亦表明，大鼠吸入Fe2O3纳米粒子92 mg·m-3，每天6 h，连续3 d，出现较弱的呼吸道反应[11]。Wesselius等[12]研究发现，Fe2O3纳米粒子引起的细胞毒性是由于细胞内的氧化效应。此外，Wang等[13]认为，Fe2O3纳米粒子能够引起细胞内氧自由基的增加，从而导致小鼠巨噬细胞细胞膜通透性增加，抑制钠-钾ATP酶和钙-镁ATP酶活性，损伤膜功能，导致巨噬细胞的肿胀、变性和坏死，而巨噬细胞的功能性损伤将会影响到机体免疫系统的平衡。Kim等[14]对多吡咯纳米粒子引起的细胞毒性和其对免疫系统的影响进行了研究，结果表明，用多吡咯纳米粒子20，40，60，80和100 nm分别以不同的浓度10，25，100，250和500 g·L-1作用于人肺成纤维细胞IMR90和大鼠肺泡巨噬细胞J774A.1细胞24 h，其对细胞存活、氧化应激、细胞凋亡率和坏死率的影响均具有尺寸和浓度依赖关系，即随着尺寸的减小或浓度的增大，其毒性增大。通过测定巨噬细胞表面协同刺激分子的表达来分析多吡咯纳米粒子引起的免疫应答，发现与辅助性T细胞1(T helper cells 1，Th1)应答相关的协同刺激分子CD40和CD80的表达上调(P＜0.05)，与Th2细胞应答相关的协同刺激分子CD86的表达下降(P＜0.05)。纳米粒子在药物递送系统的应用中，用聚乙二醇进行表面修饰可以延长纳米粒子在血液中的循环，并特异性地降低脾和肝固有吞噬细胞对其的摄取[15]。

NK T细胞是T细胞的一个亚群，与树突状细胞(dendritic cell，DC)和巨噬细胞共同参与早期免疫应答产生的细胞因子种类及水平的平衡调节，决定所产生的免疫类型。但NK T细胞易被诱导无反应性。Thapa等[16]将α-半乳糖神经酰胺(α-galactosylceramide，α-Gal)结合到聚乳酸纳米粒子上，制备成α-Gal纳米粒子，在体内外检测其对NK T细胞的刺激作用。结果显示，与可溶性的α-Gal相比，α-Gal纳米粒子能够持续刺激NK T细胞活化而不会诱导NK T细胞无反应性，这就解决了α-Gal存在的诱导NK T细胞无反应性这一问题。此外，他们还发现，纳米粒子表面电荷的修饰或配体的修饰能够加强免疫器官中DC对纳米粒子的摄取和吸收。

补体系统是体内重要的免疫效应系统和效应放大系统，参与机体的抗感染及免疫调节，也可介导病理性反应。在正常生理情况下，绝大多数补体固有分子均以酶原或非活化形式存在于血清中，在某些启动因素作用下，补体分子按一定顺序以连锁反应的方式依次活化，形成一系列放大的级联效应，最终导致一系列生物学效应，发挥免疫调节作用。Salvador-Morales等[17]采用新鲜的人血清通过溶血实验、Western印迹和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证明了碳纳米管可以通过经典途径和旁路途径活化补体系统，其机制可能是碳纳米管直接与C1q(经典途径)和C3b(旁路途径)结合或C1q和C3b通过与血浆或血清蛋白结合后然后吸附到碳纳米管上，从而激活补体系统并导致炎性肽C3a，C4a和C5a的产生;他们同时观察了碳纳米管对补体和血浆蛋白的作用，结果表明，碳纳米管可以增强抗原的免疫原性，因此碳纳米管可作为免疫佐剂增强机体的免疫应答。但同时碳纳米管也会引起炎症反应和肉芽肿的形成，激发补体过度活化而造成免疫损伤，从而介导病理性过程。

在非特异性病原体清除过程中，纳米粒子起着重要的作用。纳米粒子能够诱导补体的活化，从而加强B细胞介导的细胞免疫应答，并促进DC和T细胞的活化[18]。

2 对特异性免疫系统的影响

2.1 对抗原递呈细胞的影响

有研究发现，纳米粒子是免疫应答的活化剂，能够影响免疫细胞的活性，促进免疫应答的发生。在特异性免疫应答中，抗原递呈具有重要作用，抗原递呈细胞对抗原的识别与递呈是机体免疫反应的首要环节。

DC是目前所知的机体内功能最强的专职性抗原递呈细胞，是机体免疫反应的始动者。DC在宿主免疫防御方面起着重要的作用，如清除外来病原体、抑制肿瘤发生等。有研究结果显示，纳米粒子能够促进DC细胞的成熟和对抗原的递呈。Akagi等[19]将灭活的HIV病毒抗原包裹在疏水性多聚谷氨酸衍生物纳米粒子中，这种载有HIV病毒抗原的纳米粒子能被未成熟的DC捕获，进而诱导这些未成熟的DC成熟，从而发挥抗原递呈作用。他们发现，这种装载了HIV病毒的纳米粒子可诱导产生抗原特异性细胞毒反应。Yang等[20]研究发现，[Gd@C82(OH)22]n纳米粒子是 DC 和 Th1细胞免疫应答的有效的活化剂，它们从以下三方面促进DC表型的成熟:① 刺激DC产生IL-12 p70等细胞因子;② 使DC协同刺激分子CD80，CD83和CD86和主要组织相容性复合体 (人类白细胞抗原-A，-B，-C和-DR)分子的表达上调;③使DC从CCL5敏感型向CCL19敏感表型转化。他们还发现，此类纳米粒子是Th1细胞免疫应答的活化剂，能使卵白蛋白(ovalbumin，OVA)特异性Th1细胞免疫应答水平加强。纳米粒子表面用壳聚糖和甘露糖修饰使其功能化，通过特异的吞噬途径能将纳米粒子传递给巨噬细胞和DC，因而增强纳米粒子所连接抗原的免疫应答[21-23]。

但也有学者发现，一些纳米粒子会使DC的功能下降。例如，Blank等[24]发现，用聚乙烯醇包衣的表面顺磁的氧化铁纳米粒子能使人单核细胞演变的DC加工抗原，刺激CD4+T淋巴细胞增殖，诱导生成细胞因子的能力下降。

2.2 对T淋巴细胞的影响

CD8+T细胞主要为细胞毒T淋巴细胞亚群，主要通过特异性细胞毒效应和分泌释放γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α )和TNF-β 等细胞因子介导特异性免疫效应，参与细胞免疫应答及免疫调节。CD8+T细胞对靶细胞的杀伤作用具有抗原特异性。Wang等[25]研究发现，将 HIV-1外膜蛋白 gp120结合到多聚 γ-谷氨酸〔poly(γ-glutamic acid)，γ-PGA〕纳米粒子上能够诱导更为强烈的细胞免疫应答，促进长时效的记忆性CD8+T淋巴细胞的形成。γ-PGA纳米粒子是极好的疫苗载体，它能传递抗原给抗原递呈细胞，并激活抗原特异性细胞毒T淋巴细胞的免疫应答[26-28]。Yoshikawa等[26]发现，小鼠皮下免疫 γ-PGA纳米粒子包裹的OVA与弗氏完全佐剂乳化的OVA比较，能更加高效地抑制OVA转染的肿瘤细胞的生长。而且，γ-PGA纳米粒子不会引起皮下接种组织病理学的改变且静脉注射也不会引起严重毒性。Chen等[29]发现，静脉注射Fe3O4磁性纳米粒子能够以剂量依赖的方式影响正常ICR小鼠的免疫功能。低剂量(5.14 mg·kg-1)组Fe3O4纳米粒子淋巴细胞增殖率高于对照组，而溶媒组(生理盐水)和高剂量(51.4 mg·kg-1)组的淋巴细胞增殖与对照组相比却较低。在外周血中，低剂量(5.14 mg·kg-1)组的CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的比例要高于对照组。Fe3O4纳米粒子还能够促进IL-2，IFN-γ和IL-10的分泌。此外，Thapa等[16]研究发现，纳米粒子可被α-Gal和蛋白/肽抗原同时包被，作为独特的疫苗佐剂。将OVA和gp100的黑色素瘤抗原肽共轭结合到α-Gal包裹的纳米粒子上，能够诱导有效的抗原特异性CD8+T细胞免疫应答。Stano等[30]将OVA共轭结合到聚丙烯硫化物纳米粒子上，发现可诱导肺组织和脾组织的细胞毒T淋巴细胞的免疫应答;此外，将Toll样受体的配体鞭毛蛋白作为免疫刺激佐剂共轭结合到聚丙烯硫化物纳米粒子上，发现可诱导以Th1细胞为主的细胞免疫应答。

2.3 对B淋巴细胞的影响

B淋巴细胞是机体体液免疫的主要细胞。Inoue等[31]研究发现，内燃机车排气中富含的纳米粒子能以剂量依赖的方式显著增加脾细胞表面CD11C，CD80和CD86这些促进DC成熟、活化及CD69和CD40L这些促进T细胞活化的分子的表达。

Nygaard等[32]研究发现，单壁纳米碳管(single-walled carbon nanotubes，swCNT)和多壁纳米碳管(multi-walled carbon nanotubes，mwCNT)可增强小鼠的过敏反应。他们采用变应原OVA致敏，将BALB/c小鼠暴露在swCNT，mwCNT和超细炭黑粒子(ultrafine carbon black particles，ufCSP)中，检测血清中针对OVA的特异性抗体IgE，IgG1，IgG2α和支气管肺泡灌洗液中炎症细胞的数量及细胞因子水平。结果发现，swCNT和mwCNT与OVA同时作用于小鼠，血清中OVA特异性抗体IgE水平升高，支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量增加，纵隔淋巴结中与Th2细胞相关的细胞因子的分泌增强。而mwCNT和ufCSP分别与OVA作用于小鼠，支气管肺泡灌洗液中IgG2α、中性粒细胞、TNF-α和单核细胞趋化蛋白1的水平增加。

Stano等[30]将OVA共轭结合到聚丙烯硫化物纳米粒子上，其可诱导黏膜的体液免疫应答;此外，还发现将Toll样受体的配体鞭毛蛋白作为免疫刺激佐剂共轭结合到聚丙烯硫化物纳米粒子上可使气道、阴道和直肠黏膜的体液免疫应答增强。Gou 等[33]对聚 ε-己内酯-聚乙二醇-聚 ε-己内酯〔poly(ε-caprolactone)-poly(ethylene glycol)-poly(ε-caprolactone)，PCEC〕纳米粒子和阴性甘露聚糖修饰的PCEC(MPCEC)纳米粒子进行了研究，通过静电作用将人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)吸附到阴性的纳米粒子表面，然后将吸附bFGF的纳米粒子皮下注射给小鼠，结果发现，bFGF-MPCEC复合体与bFGF-PCEC和bFGF+铝盐佐剂相比，自身抗体 IgG，IgG1和IgG2α水平升高。他们认为，这是由于甘露聚糖功能化的MPCEC纳米粒子能够靶向DC，从而使体液免疫应答增强导致的。

Sarti等[34]将OVA 和单磷酰脂质 A(monophosphoryl lipid A，MPLA)结合到聚乳酸聚乙醇酸共聚物纳米粒子上，与OVA+PBS组相比发现，OVA特异的IgG免疫应答显著提高;此外，IgA抗体水平也显著高于对照组。Huang等[35]研究发现，将灭活的H5N1流感病毒和CpG(一种包含有未甲基化的胞嘧啶-鸟苷模体的免疫刺激的寡聚脱氧核苷酸)包裹进乳化的纳米粒子中，也对体液免疫产生影响。

此外，有学者对纳米红色元素硒进行了研究。纳米红色元素硒是以蛋白质为分散剂的一种纳米粒子，粒径为20～60 nm。Gao等[36]采用动物实验研究纳米红色元素对免疫功能的调节作用，发现纳米红色元素对小鼠免疫功能有明显的调节作用，硒50.0 μg·kg-1组小鼠的细胞免疫功能、体液免疫功能和巨噬细胞吞噬功能明显增强。

此外，一些纳米粒子对免疫排斥反应还具有抑制作用。例如，Chen等[37]研究发现，聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子在腹腔内移植猪肝细胞治疗大鼠急性肝衰竭过程中对体液免疫排斥反应具有一定的抑制作用。

3 对炎症反应的影响

已有研究发现，纳米粒子因其比表面积大，且能够渗入呼吸道，因此可导致严重的炎症反应。Inoue等[38]研究了纳米粒子的尺寸效应对细菌内毒素引起的肺炎的影响，发现碳黑纳米粒子能够增强与气道炎症反应相关抗原的免疫原性。炭黑纳米粒子可加剧与细菌内毒素相关的肺炎。在整体水平上，14 nm纳米粒子较56 nm纳米粒子的作用更为明显，14 nm粒子能显著加重脂多糖诱发的肺炎和肺水肿，而且增加肺部IL-1β，巨噬细胞炎性蛋白1ɑ，巨噬细胞趋化蛋白1、巨噬细胞炎性蛋白2和角化细胞趋化因子的分泌，而56 nm粒子无明显影响。Han等[39]研究也发现，对于OVA诱导的大鼠哮喘模型，气管内吸入纳米SiO2能够导致气道高反应性和气道重构。他们认为这可能是纳米SiO2促进组织分泌IL-4而导致Th1/Th2细胞产生细胞因子的不平衡造成的。

Li等[40]认为微粒导致炎症反应的机制之一是产生氧化应激，微粒诱导的氧化应激所产生的细胞效应包括氧化剂的活化、炎症反应和毒性反应。微粒导致肺部炎症反应的前期主要是细胞因子和趋化因子的产生和黏附分子的表达。

导致炎症反应并不是纳米粒子的特性。据报道，一些纳米粒子还具有保护性治疗作用。Park等[41]研究了银纳米粒子对支气管炎和气道高反应性的影响，结果表明，银纳米粒子可能具有减弱抗原诱发的气道炎症反应和高反应性的能力。他们采用OVA致敏的过敏性气道反应疾病的小鼠模型来评价银纳米粒子在过敏性气道疾病的作用和相关分子机制。小鼠在吸入OVA后，炎症细胞数量升高，气道反应性高，肺部的IL-4、IL-5、IL-13和 NF-κB 水平升高;而在给予银纳米粒子后，上述指标均显著降低。此外，他们还发现，在吸入OVA后，肺泡支气管灌洗液中升高的细胞内活性氧水平在给予银纳米粒子后下降。这些发现可能揭示银纳米粒子保护和治疗哮喘的可能的分子机制。此外，Liu等[42]发现，聚乳酸聚乙醇酸共聚物-蒿属花粉纳米疫苗免疫治疗小鼠哮喘有良好疗效，其机制可能与调节Thl/Th2细胞平衡有关。Yudoh等[43]研究发现，水溶性的C60(碳60)可以作为抑制关节炎的抗氧化治疗剂。

4 结语

免疫系统是生物体内最为复杂且重要的系统，其复杂性在于机体内存在不同的免疫器官发挥着不同的功能，且免疫细胞的种类亦多种多样，而每种细胞又都有复杂的功能。其重要性是由于其担负着机体的免疫防御、免疫监视和免疫自稳的功能，维持机体的正常功能与状态。研究表明，机体绝大多数生物反应都有免疫系统的参与，长久以来免疫系统一直是生物学研究的热点。

随着纳米粒子对机体作用研究的不断发展和深入，其特殊的结构和性质在应用中表现出较多的优势。近年来纳米粒子在抗肿瘤免疫辅助治疗、抗肿瘤靶向治疗、免疫调节和基因疫苗开发等方面取得了明显进展。

纳米粒子作为抗肿瘤药或疫苗载体治疗疾病的同时，对免疫系统亦产生很大的影响，虽然对纳米粒子已有了较多的研究，但对纳米粒子对免疫系统的生物学效应和毒理学效应的认识还十分有限。这方面的研究将受到越来越多的关注，成为纳米生物医学研究中一个新的重要方向。相信在不久的将来，人们一定会对纳米粒子的生物学效应有更加全面的了解与认识，从而为人类的健康作出贡献。

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