牛地方流行性白血病诊断技术的研究进展

林 立 孔繁德

（厦门出入境检验检疫局，厦门 361012）

牛地方流行性白血病（EBL），又称牛病毒性造血细胞组织增生症、牛淋巴肉瘤、牛恶性淋巴瘤、牛白血病复合症等，该病是由牛白血病病毒（BLV）引起的牛的一种慢性肿瘤性疾病，该病毒属于C型致瘤病毒属，反转录病毒科（Retroviridae）致瘤病毒亚科（Oncoviridae）的RNA病毒，含单股RNA，该属病毒与C型病毒的形态和装配方式十分相似。BLV呈球状，少数棒状，大小不一，平均直径80～100 nm，有囊膜，囊膜上有纤突。核衣壳呈20面体对称，内为螺旋状结构的类核体，核内携带反转录酶。此病毒的结构蛋白已知有几种，但主要的是芯髓和囊膜，其中芯髓含有能抵抗乙醚的分子量为2.1万～2.5万个的编码（P）蛋白质，主要有P10、P12、P15、P19、P24、P53和P80；囊膜含有对乙醚有感受性的糖蛋白（称为gp），主要有gp35、gp45、gp51、gp55、gp60和gp69等[1，2]。在这些蛋白中以gp51和P24的抗原活性最高，用这2种蛋白作为抗原进行血清学试验，可以检出特异性抗体。

该病特征为淋巴样细胞恶性增生、进行性恶病质和发病后的高死亡率。该病最早在1878年由德国首次报道，但直到l969年才由美国的Miller从病牛外周血液淋巴细胞中分离到病毒。此病在我国于1974年首次发现于上海，此后逐步蔓延到全国其他省市。现在，该病已成为牛的重要传染病之一，而且具有进一步蔓延，甚至死灰复燃的趋势。例如，芬兰自1996年以来从未发现BLV病例，1999年芬兰宣布全国消灭BLV。但是，在2008年4月2日，芬兰农林部向OIE报告了新的BLV疫情通告[3]。因此，为了有效控制BLV的发生、发展，有必要对其最新的诊j技术进一步了解。本文将从BLV的流行病学、临床症状、病理变化、临床诊断与实验室检测几个角度，较为全面的综述该病研究进展情况。

1 流行病学

感染病牛终生带毒，成为传染源。BLV的传播方式有垂直传染和水平传染2种[2，3]。前者包括先天性传染，母牛通过子宫胎盘将病毒传递给胎儿或通过胚胎移植传播病毒，这种感染可能发生在免疫力建立之前。犊牛在出生后食初乳之前，体内已有病毒和相应的抗体；后者则可能通过血源性传播（如由病毒污染的器械、兽医采血、注射、手术等）、分泌物性传播（如鼻腔分泌物、唾液、支气管-肺泡洗出液、尿液、粪便、子宫冲洗液和精液等）、接触性传播（该种传播实际上多是媒介的传播）、寄生昆虫的传播（寄生昆虫在吮吸病牛血后，很有可能将感染的淋巴细胞传播到其他的健康牛）、精液性传播（如人工输精，但精源性传播在BLV的感染中机会很小），生物制剂的应用、新生犊牛吃病母牛的初乳、常乳及其制品等，也可传染发病。

2 临床症状

Bendixen（1965）曾以临床病理学方法将牛白血病分为地方流行型牛白血病（成牛型白血病）和散发型牛白血病（犊牛型、胸腺型和皮肤型）。因此，根据临床病理学变化，将临床症状分为以下几型[4]：

2.1 地方流行型

以4～8岁奶牛多发。多数感染牛不呈现临床症状，以在血液中存有白血病抗体并出现持续的淋巴细胞增多症和异常淋巴细胞为特征。只有生成肿瘤之后，才出现体表或颈浅淋巴结及内脏淋巴结肿大。直肠检查可触摸到肿大的内脏淋巴结。由于肿瘤部位机械性损伤和压迫作用，使病牛呈现相应的临床症状。病牛食欲不振，体重减轻，发育不良，全身乏力，泌乳性能明显降低，可视粘膜苍白或黄染，前胃驰缓和瘤胃臌气等。当侵害心脏时，心搏动亢进，心跳加快，心音异常，出现瘤块压迫性呼吸、吞咽困难，全身出汗，眼球突出，胸前浮肿，腹泻，粪如泥样，有恶臭味，混有血液，尿频或排尿困难。当骨盆腔及后腹部发生肿瘤时，病牛呈现共济失调，跛行。起立困难，被迫横卧地上。子宫肿瘤病牛，发生流产、难产或屡配不孕。

2.2 犊牛型

常见于6个月龄以内的犊牛或青年牛。淋巴结肿大，精神不振，全身虚弱无力，个别的病牛发热，心动过速，可视粘膜发绀或黄染。食欲不振，全身出汗，腹泻，驻立困难而卧地。由于内脏发生的瘤块压迫，呈现瘤胃臌气和充血性心力衰竭等症状。

2.3 胸腺型

以7～24个月龄以内的小牛多发。胸腺呈块状肿大，其邻近局部淋巴结被侵害、肿大，引起颈静脉怒张、静脉波动和局部浮肿。有的出现发热、瘤胃臌气等症状。

2.4 皮肤型

幼龄牛皮肤出现荨麻疹样皮疹，以真皮层为主形成肉瘤。成年牛常于颈、背、臀及大腿等处发生肿块。

3 病理变化

3.1 病理组织学检测

将阳性牛进行病理剖检，采取淋巴结、胸骨、心、肺、肝、肾、脾、胃肠等器官和肌肉，用10%的福尔马林、酒精、AF等固定液固定，石蜡包埋切至3～4 μm和6～8 μm，同一组织块制成3张切片，分别以H·E染色、PTAH、Lordonit网状纤维、Van Gesonit胶原纤维染色，对比观察组织学变化。结果表明，病牛淋巴结肿大，遍及全身和各脏器，形成大小不等的结节性或弥漫性肉芽肿病灶，尤其真胃、心脏和子宫等为最常发的器官[4]，同时容易诱发机会性感染。

3.2 病理形态学检测

病理形态学方法主要检查淋巴结、脾、骨髓以及肝、肾、心肌等变化，可发现持续性的淋巴细胞恶性增生，并形成肉眼可见的淋巴细胞肉瘤。

4 实验室检测

4.1 血液学检测

血液学方法是以检查外周血液中白细胞数增多为基础。一般间隔2～3月进行1次补充的血液学分析，直到获得连续2次相同的位于正常血液学数据的结果为止。国际上一般采用Bendixen氏检索表进行BL牛血液学检查。南京农业大学、上海兽医研究所、哈尔滨兽医研究所等根据当地情况和血检诊断BL时除了要看淋巴细胞绝对数的增多变化，还必须看是否出现成淋巴细胞或前淋巴细胞等肿瘤细胞及核分裂等现象综合评定。

4.2 血清学检测

血清学方法主要以免疫琼脂扩散检测（AGID）BLV沉淀抗体，此抗体能在感染后2个月出现，并保留终身。其他的方法主要包括免疫荧光抗体法、补体结合反应、酶联免疫吸附试验、放射免疫测定法、血凝试验、病毒中和试验、对流免疫电泳技术、单克隆抗体技术、免疫印迹技术、亲合素－生物素过氧化物酶系统测定等方法。若检出白血病抗体，即可确诊为病毒感染。

4.2.1 单克隆抗体技术（McAb）

单克隆抗体技术主要是用来检测BLV抗原。相较抗原的其他几种检测方法，例如依靠电子显微镜或免疫电镜技术，由于BLV在宿主细胞内复制量有限，往往很难观察到病毒粒子，而逆转录酶活性测定，由于操作繁琐，要求条件高，特异性较差，也很难推广应用，所以基于单克隆抗体（MAB）的相关技术得到了发展。赵化民等应用抗BLV糖蛋白（gp）抗原MAB探针，采用抗原捕获试验（MABACA）检测BLV抗原，并与AGID和ELISA比较，结果表明MAB-ACA的敏感性显著高于AGID技术，特异性明显高于ELISA，而且该方法的稳定性和重复性好，在BLV抗原检测方面有着一定的优势[5]。

4.2.2 酶联免疫吸附（ELISA）

采用酶联免疫吸附检测血清主要针对的是抗gp51和p24抗体。间接法是先将提纯的抗原包被到固相载体，再加试验血清和特异性lgG结合物；阻断法是利用试验血清中的抗体干扰或阻断标准抗原-抗体反应。Gutierrez等[6]研制了一种新的阻断ELISA，该方法以gp51为抗原，对牛血清和乳样品中BLV抗体的检测具有特异和敏感的特点。赵显文等用免疫亲和层析提纯技术获取高纯度的BLV抗原，建立一种快速特异的斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA），用于检测BLV血清抗体。其检测结果阳性者完全覆盖并高于ID试验的检出率，与ELISA法测得阳性结果完全符合。该法比ID试验高5.6%，并可提前60多个小时报告结果；比ELISA法亦可提前10几个小时得出结果。该法不需要特殊仪器设备，是一种特异性强，敏感性良好而且快速的免疫学检测方法[7]。目前，关于牛白血病ELISA检测试剂盒的研究与开发也得到了进一步的推广与应用[8]。

4.3 分子生物学检测方法——聚合酶链式反应（PCR）

目前，分子生物学检测方法由于具有高度敏感的特点，在病原检测里面占据重要地位。聚合酶链式反应是比较灵敏的直接检测BLV前病毒的方法之一。Naif等[9]采用PCR检测BLV，可从感染宿主检测到100 ng前病毒DNA，使本试验的敏感性提高了2个对数级数，而且，无论是在淋巴细胞还是在肿瘤细胞，以及各个感染时期都可检出前病毒DNA。Agresti等[10]应用PCR诊断初生牛犊BLV，DNA扩增靶物采用BLV前病毒基因组中位于gag和env基因区的2个片断（分别为277 bp和220 bp），参照BLV前病毒核苷酸序列设计合成寡核苷酸引物（20 bp）和杂交探针（29 bp），进行PCR试验。结果表明，PCR技术诊断犊牛出生前后感染BLV是可靠的。其他的一些新型PCR技术也得到了开发。例如，巢式PCR（Nested PCR），利用2套PCR引物（巢式引物）进行2轮PCR扩增反应，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与2套引物都互补的模板很少）增加了检测的敏感性；同时2对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。该方法能从两个BAT-BLV细胞内检测出BLV的前病毒DNA形式[11]。刘志玲等[12]采用LUXTM新型荧光PCR技术原理，设计并合成1对单标记LUXTM荧光引物，建立了LUXTM荧光PCR和RT-PCR方法，可快速检测BLV前病毒DNA和病毒RNA。敏感性实验表明，LUXTM荧光RT-PCR对RNA前病毒的检测敏感性达0.49 ng/μL，荧光PCR对pTblv-gp51重组质粒的检测敏感性可达0.138拷贝，比OIE规程的巢式，PCR方法高104倍以上。

4.4 其他

血液学、血清学、病理形态学以及组织学检测除了以上常规操作外，还存在一些其他的诊断检测手段，现分述如下：

4.4.1 色氨酸代谢

谢占武等人探讨了地方流行性牛白血病与色氨酸（Trp）代谢的关系。结果表明，经荧光法测定琼扩阳性牛、羊血清和牛奶中的Trp含量明显高于琼扩阴性对照组，此结果与原苏联学者的报道一致，表明可采用此法作为生前诊断BLV的一种生化指标。由于该法检测用量少，操作简单，只要有荧光分光光度计即可应用，3 h内即可得出准确结果[13]。

4.4.2 胶体金免疫层析法

宋阳威等以胶体金标记的羊抗牛IgG（Fc）抗体作为标记抗体，将纯化的His-gp51重组蛋白和羊抗牛IgG分别标记于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线，各部件按序装配形成快速诊断试纸条。对22份样本分别用试纸条和ELISA试验进行检测，2种方法的阳性符合率为88.9%（8/9），表明该研究建立的胶体金免疫层析方法简便、快捷，具有较好的特异性和一定的敏感性，适宜基层初筛诊断和现场应用[14]。

[1]De Giusepe A，Teliziani F，Rutli D，et al.Expression of the bovine leukemia virus envelope glycoprotein（gp51）by recombinant baculovirus and its use in an enzyme-linked immunosorbent assay[J].Clin Diagn Lab Immunol，2004，11（1）：147- 151

[2]Johnston ER，Albritton LM，Radker K.Envelope proteins containing single amino acid substitutions support a structural model of the receptor-binding domain of bovine leukemia virus surface protein[J].J Virol，2002，76（21）：10861- 10872

[3]中国动物卫生与流行病学中心国际兽医事务综合分析室.2008年3-4月全球重大动物疫情综述[J].中国动物检疫，2008，25(5):49

[4]吴明权，黄丽辉，刘丽.牛白血病的诊断要点及防治措施[J].畜牧兽医科技信息，2005，（5）：44

[5]赵化民，徐振东，刘焕章.单克隆抗体探针在地方流行性牛白血病诊断中的应用研究[J].中国兽医科技，1991，21（5）：3- 5

[6]Gutierrez SE，Dolcini DL，Arroyo GH，et al.Development and evaluation of highly sensitive and specific blocking enzyme-linked immunosorbent assay and polymerase chain reaction assay for diagnosis of bovine leukemia virus infection in cattle[J].American J of Vet Res，2001，62（10）：1571- 1577

[7]赵显文，范秀媛，孙姝，等.Dot-ELISA检测牛白血病病毒抗体的研究[J].中国兽医科技，1993，23（12）：3- 6

[8]De Giuseppe A，Feliziani F，Rutili D，et al.Expression of the bovine leukemia virus envelope glycoprotein（gp51）by recombinant baculovirus and its use in an enzyme-linked immunosorbent assay[J].Clin and Diagnostic Lab Immunol，2004，11：147- 151

[9]Naif HM，Brandon RB，Daniel RCW，et al.Bovine leukaemia proviral DNA detection in cattle using the polymerase chain reaction[J].Vet.Microbiol，1990，25（2-3）：117- 129

[10]Agresti A，Ponti W，Rocchi M，et al.Use of polymerase chain reaction to diagnose bovine leukemia virus infection in calves at birth[J].American J of Vet Res，1993，54（3）：373- 378

[11]王汉中.Nested PCR在检测牛白血病病毒前病毒中的应用[J].中国病毒学，1995，10（4）：351- 355

[12]刘志玲，陈茹，马静云，等.牛白血病病毒LUXTM实时荧光聚合酶链式反应检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2009，31（5）：383- 387

[13]谢占武，邓上奇，刘瑞凝，等.地方流行性牛白血病患畜的色氨酸代谢[J].中国预防兽医学报，1992，4：53- 54

[14]宋阳威，张鑫宇，张常印，等.牛白血病病毒GP51蛋白在大肠杆菌中表达及胶体金免疫层析试纸条检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2010，32（4）：272- 275