氧化应激对骨髓间充质干细胞的影响

卢文艺，赵明峰

天津医科大学一中心临床学院 天津市第一中心医院血液科，天津300192

骨髓间充质干细胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)来源于非造血基质组织的前体细胞，它具有干细胞特性和多向分化能力，在严格控制的培养环境中可以分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞和肝细胞等，同时也具有一定的免疫调节能力［1］。由于MSCs具有这种多向分化能力以及免疫调节特性，其在干细胞治疗和组织工程学上的应用潜力越来越受到人们的关注［2］。氧化应激作为机体常见的生理调节机制，在MSCs的各种病理状态下起着至关重要的作用，许多研究都在致力于探索氧化应激对MSCs的作用机制。本文就氧化应激对MSCs影响的最新研究进展进行综述。

骨髓MSCs的特点及功能

骨髓MSCs具有CD45-CD44+CD105+免疫表型，且与造血干细胞类似，它具有自我更新和多向分化能力，是非造血基质组织的前体细胞，可通过分泌多种细胞因子、生长因子和构建造血微环境来支持造血干细胞的扩增［3］。骨髓 MSCs可以直接分化为成骨细胞，成骨细胞是造血微环境最重要的组成部分，其表面的N-钙黏蛋白和造血干细胞发生同型相互作用后介导造血干细胞定位到造血干细胞龛中［4］。骨髓MSCs还具有免疫调节特性，可通过影响T细胞、B细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞等多种免疫细胞来调节机体的免疫功能［5-6］。目前有关骨髓MSCs抑制T淋巴细胞的研究比较多，其作用方式可能主要通过以下3种途径:(1)MSCs可能具有“否决”样细胞 (veto cell)活性或间接通过否决细胞激活下游抑制信号来抑制T细胞;(2)通过激活调节性T细胞发挥作用;(3)MSCs诱导T细胞无反应性或通过细胞接触、细胞因子及凋亡途径等来抑制其功能［6］。

氧化应激及其病理生理机制

氧化应激是指体内活性氧 (reactive oxygen species，ROS)的生成增加和/或清除ROS的能力降低，导致ROS的生成和清除失衡，过量的ROS可引起生物大分子、细胞和机体的损伤。ROS由O2-、OH、HO2、RO2、RO等极性分子以及H2O2、O2等非极性分子构成，主要通过NADPH氧化酶途径和线粒体电子传递链途径生成［7］。为了阻止ROS的聚集，细胞内还存在多种抗氧化系统，如超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶以及一些保护细胞免受氧化应激损伤的氧化敏感型分子硫氧化还原蛋白、脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1(apurinic/apyrimidinic endonuclease/redox factor 1，APE/REF-1)。ROS的大量聚集改变了细胞内的氧化还原状态，通过氧化DNA、蛋白质、脂质等生物大分子，对细胞、组织和器官造成损害。过量的ROS通过增加线粒体外膜的渗透性，诱导线粒体渗透性转移，使细胞色素C、凋亡诱导因子等促凋亡因子漏出，诱导细胞凋亡［8］。ROS还可通过增加端粒的损耗，使细胞周期停滞、加速细胞衰老。另外，ROS可触发多种信号转导途径，如AKT、p38丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinase，MAPK)、p53，最终导致细胞衰老或凋亡等不同反应。

氧化应激对骨髓MSCs的影响

作为影响细胞存活的重要因素之一，氧化应激可诱导骨髓MSCs的衰老及凋亡，阻碍其增殖并向成骨细胞分化的能力，该过程主要涉及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)、p53、p38 MAPK、APE/REF-1等信号转导途径。人们通过大量的研究还发现，通过对MSCs进行预处理可以减少氧化应激对骨髓MSCs的损伤，这对进一步探索氧化应激对骨髓MSCs的损伤机制意义重大。

氧化应激引起骨髓MSCs的衰老和凋亡及相关机制MSCs的衰老及凋亡会损伤组织和器官的修复能力，这是干细胞应用于治疗中的一个重大问题。与胚胎干细胞不同，骨髓MSCs不具有无限自我更新的能力，它们复制的能力逐渐退化，最终会衰老死亡，这也被称为复制性衰老［9］。而氧化应激导致的细胞内ROS大量聚集可使骨髓MSCs出现应激诱导的早熟性衰老 (stress-induced premature senescence，SIPS)，SIPS和复制性衰老都具有相似的形态学特征、β-半乳糖激酶活性及细胞周期停滞的特点［10］。细胞内过量的ROS还可通过p53途径诱导细胞凋亡。通过抗氧化剂调控细胞内的ROS水平可以维持骨髓MSCs的特性，增加其存活，这更加证实了ROS对MSCs的作用。

众多研究表明，ROS可通过多种途径参与骨髓MSCs的衰老及凋亡，其中主要包括 AKT、p53、p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase，JNK)等信号分子。

PI3K/AKT是细胞在应激状态下存活的重要信号途径，它参与了体内许多生理机制的调控，如新陈代谢、细胞周期，以及细胞的迁移和生存。AKT信号途径磷酸化后可以激活B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗凋亡蛋白，它还能使 Bad、caspase-9和FH转录因子等凋亡因子失活，增加细胞的抗凋亡能力［11］。在给予AKT抑制剂阻碍AKT信号传导通路后，它在氧化应激条件下保护细胞生存的能力明显下降，这更加肯定了AKT对骨髓MSCs的保护作用。AKT的磷酸化同时能通过增加p38β的活性来降低细胞内ROS水平，抑制凋亡分子JNK［2］。不仅如此，有报道称AKT信号途径的磷酸化还和MSCs的分化相关［12］。

p53/p21Cip1在细胞周期调节、凋亡、衰老、分化等多种生物过程中起重要作用。过度的氧化应激会使细胞内聚集大量的ROS，这些活性氧簇会通过p53作用其下游靶点p21Cip1来抑制CDK/cyclin复合体的活性并下调pRb/E2F轴，最终降低MSCs的自我更新及再生能力，促使其衰老［13-15］。p53/p21途径还可通过和p16/pRb途径相互作用共同诱导细胞出现SIPS［14］。相反，有研究表明p53能感受细胞内的ROS，具有抗凋亡活性［16］。p53转录因子还参与了骨髓MSCs的凋亡，它不仅可以上调Bax、Bak等促凋亡因子，还通过下调Bcl-2、Bcl-x等抗凋亡因子来影响 MSCs的存活［13］。

另外，还有研究证实:p38 MAPK途径的激活参与调节骨髓MSCs细胞的早期凋亡，JNK信号途径则调节骨髓MSCs细胞的晚期凋亡［17］。ROS通过线粒体途径和内质网应激靶向p38 MAPK途径，p38 MAPK通过调节Bax的转移和细胞色素C的释放诱导骨髓MSCs的凋亡。增加的ROS还会激活氧化敏感型JNK信号通路，JNK发生磷酸化后会从细胞质转移到线粒体内，使线粒体发生去极化而降低线粒体的膜电位、释放线粒体中的细胞色素c入胞浆。Bax发生寡聚化并转移到线粒体膜上加速了细胞色素C的释放，进一步激活caspase-3，形成依赖caspase的凋亡途径，最终诱导骨髓MSCs的凋亡［17］。

氧化应激抑制骨髓MSCs的增殖和分化及相关机制在氧化应激条件下，ROS介导了有关细胞增殖的生长信号途径，还有一些间接证据表明，给予细胞抗氧化剂治疗后可以降低ROS对骨髓MSCs增殖及分化的影响［18］。在MSCs向成骨细胞分化过程中，抗氧化酶的合成会上调，继而ROS的生成会减少，这提示较低浓度的ROS更有利于骨髓MSCs向成骨细胞分化。体外实验已经证实外源性过氧化氢可以阻碍MSCs向成骨细胞分化，因此ROS的聚集可阻碍 MSCs的分化［19］。

虽然已经有报道指明ROS可影响MSCs的增殖及分化，但其作用途径尚未明确，仍需要大量研究进一步探索。新近研究发现，APE/REF-1及细胞外信号调节蛋白激酶 (extracellular signal-regulated kinase，ERK)信号分子涉及该过程。

APE/REF-1酶是修复氧化性损伤的限速酶，ROS对机体造成的损伤可以诱导该酶生成。APE/REF-1信号途径可以阻碍细胞内ROS的聚集，进而调控MSCs的分化［20］。APE/REF-1通过抑制 NADPH氧化酶来降低细胞内的ROS，激活型的APE/REF-1能和一些氧化应激调控转录分子如缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factors，HIF-1)、p53、活化蛋白-1结合，这些转录分子会改变应激反应信号转导通路相关基因的表达。同时，该信号途径也可通过和p53的交互作用调控MSCs的衰老。氧化型APE/REF-1能促进p53与DNA结合的同时，p53也对APE/REF-1起着负性调节作用。在内皮细胞和成纤维细胞中，氧化应激造成的细胞内ROS水平的升高会诱导APE1/REF-1的表达。然而，Heo等［20］在体外建立了MSCs的氧化应激模型，他们发现在给予H2O2处理48 h后，MSCs内表达的APE1/REF-1在转录水平和蛋白水平都出现下降。这种现象可能是因为ROS过度的聚集破坏了细胞内的抗氧化能力，激活的p53使APE1/REF-1的表达下降，进一步加重了氧化应激诱导的MSCs的衰老。

ERK信号通路与MSCs的增殖和分化有关，它属于MAPK家族。MAPK的激活可以诱导间充质向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化。MAPK途径可激活并磷酸化核结合因子α1(core binding factor α1，cbfα1)，cbfα1可诱导成骨细胞特异 Ocn基因的转录和骨髓细胞外基质的合成，该基因缺失的纯合子小鼠成骨细胞功能会丧失［21］。持续的ERK2激活可促进MSCs向成骨细胞的分化，另外它还参与了骨桥蛋白的表达、基质的沉积和矿化。关于ERK1/2对MSCs增殖的作用众说纷纭:有部分学者认为，ERK1/2途径介导了肝细胞生长因子对MSCs有丝分裂的抑制，从而阻碍了细胞的增殖;相反，还有大量证据证明ERK1/2途径能促进MSCs的增殖，用表皮生长因子处理的人骨髓MSCs表现出明显的增殖活性，实验证明这和ERK的表达呈正相关［22-23］。研究表明，抗氧化剂白藜芦醇可通过ERK途径提高骨髓MSCs的增殖能力并诱导MSCs向成骨细胞分化，且应用ERK特异性抑制剂PD98059后，抗氧化剂的作用明显被抑制［18］。由此可见，ROS很有可能通过该途径影响骨髓MSCs的增殖与分化。

有趣的是，衰老相关的信号途径也同时介导着骨髓MSCs的分化，研究证明PI3K也是MSCs分化的关键点，随后对大量衰老相关蛋白的检测更加证实了这点［24］。这提示要将MSCs的多种生物学行为联系起来才能认清其作用机制。

抗氧化应激预处理可增强骨髓MSCs的功能氧化应激对骨髓MSCs的作用严重影响其存活，增加其抗氧化应激能力成为提高MSCs移植效果的突破点。最近，越来越多的报道表明，用趋化因子、生长因子、药物、缺氧等因素预处理可以明显改善MSCs的存活能力，预处理的细胞能减少ROS对细胞活性、细胞膜以及氧代谢的损害，并增加HIF-1α、生存素、磷酸化的AKT以及Bcl-2基因和蛋白水平的表达［25-27］。

越来越多的研究证实对骨髓MSCs进行抗氧化剂及其他药物预处理可增强MSCs的抗氧化应激能力［25-26］。有研究表明，用扩血管药物二氮嗪预处理可通过核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信号传导通路在预处理晚期保护骨髓MSCs免受氧化应激损伤。众所周知，ROS可以通过激活NF-κB途径发挥氧化应激反应，而多项研究表明激活的NF-κB可能和细胞发生癌变有关，所以对该途径的精确调控是细胞凋亡和癌变的关键［26］。另外，一些抗氧化剂还可以通过抑制JNK的磷酸化来降低氧化应激对骨髓 MSCs的损伤［2］。

基于对组织进行缺血预处理可以保护缺血组织的损伤，人们提出了对干细胞进行缺氧预处理可以改善氧化应激下干细胞的存活。长期的缺氧可以导致细胞内NADPH氧化酶途径激活，增加了ROS的产生，而且还能通过减少过氧化氢酶的表达来减少ROS的降解，使细胞处于氧化应激状态。然而，缺氧预处理可以减少缺氧诱导的氧化应激对细胞造成的损伤，它不仅能通过增加AKT、Bcl-2等“存活基因”的表达来增加骨髓MSCs的存活，而且可以增加SOD等抗氧化酶水平来降低细胞内的ROS水平。同时，缺氧预处理还能恢复因缺氧造成的细胞流动性的改变［27］。

需要指出的是，氧化应激通过这些不同信号通路作用于骨髓MSCs所产生的作用是一个多因素综合的结果，信号之间会相互影响交织成一个复杂的信号传递网络从而维持骨髓MSCs的正常功能，所以就会出现不同研究对同一信号通路相关激酶的激活和抑制都会对骨髓MSCs产生相同的作用。因此，需要对多种信号通路综合分析才能更清楚地认识到氧化应激对骨髓MSCs作用的结果。

结 语

氧化应激可通过多种信号转导途径来影响骨髓MSCs的存活、衰老及增殖分化，各种干预措施可以通过改变ROS的代谢及作用于相关信号转导途径来调节骨髓MSCs的生物学行为。ROS对骨髓MSCs的作用也启示可以通过ROS介导的信号途径来调控白血病干细胞的分化、凋亡及衰老，这对治疗恶性血液系统疾病具有深远的意义。氧化应激对MSCs的影响不仅为干预造血性疾病找到了新的靶点，而且为MSCs的体外扩增及修复受损组织提供了有力保障，使MSCs能广泛地应用于消化、循环、神经、免疫等多种系统疾病的治疗中。

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