小鼠血管内皮细胞的原代培养

栗一帆，梁志伟，姜惠敏

（1.山西省肿瘤医院 普外二科，山西 太原 030013；2.洪洞县人民医院，山西 洪洞 031600；3.山西中医学院，山西 太原 030000）

血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）位于整个循环系统的内表面，具有抗凝、调控血管通透性、维持血管壁完整性、改变脂质代谢和免疫调节等多项生理功能［1］。研究表明，移植心脏的慢性排斥反应表现为迅速进展的动脉粥样硬化而导致移植物的丧失［2］。通过体外培养建立稳定的血管内皮细胞系，对于研究移植心脏免疫排斥反应具有重要意义。

1 材料

1.1 实验动物

C57BL小鼠（山西医科大学动物中心）。

1.2 主要试剂

DMEM高糖培养基（GIBCO公司），新生牛血清（杭州四季青公司），兔抗鼠抗Ⅷ相关抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），羊抗兔IgG工作液（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 主要仪器

CO2水套培养箱（美国Reveco公司），倒置相差显微镜（重庆光学仪器厂XS2－D2），倒置荧光显微镜（日本OLYMPUS，BX51）。

2 方法

2.1 取材

将小鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（50mg／kg）麻醉，75%酒精浸泡全身消毒5min。在超净工作台内无菌状态下剪开胸腔，取出腹主动脉至髂总动脉分叉处。用眼科剪、镊将血管剪碎，PBS液反复冲洗后置于DMEM培养液中备用。

2.2 原代培养

吸取组织块接种到培养瓶内，将培养瓶倒置于37℃、5%CO2的培养箱中，使组织贴壁20min后，沿培养瓶侧壁轻轻加入少许DMEM培养液，以刚没过植块为宜，放入培养箱中继续培养24h，在倒置显微镜下观察植块贴壁和血细胞迁出情况。组织块植入后最先游出的是成纤维细胞，其次是平滑肌细胞，将织块周围迁出大量血细胞的组织块可吸出接种到另一新培养瓶内再次重复贴壁20min的步骤，组织块植入后48h无论血管内皮细胞迁出与否，将组织块去掉，并更换培养液，防止成纤维细胞等其他细胞迁出，以使培养瓶中贴壁生长的主要为血管内皮细胞。

2.3 细胞传代的方法

吸去或倒掉瓶内旧培养液。PBS液清洗两次。向瓶内加入适量的消化液，在倒置显微镜下观察，当胞质回缩、细胞间隙增大时，加含血清的培养液迅速终止消化。弃去瓶内液体，加入含10%新生牛血清的DMEM培养液反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到。计数，分别接种到新的培养瓶内。细胞原代及传代培养中，一般3～7d换液1次，主要根据细胞生长情况及培养液的颜色变化确定。当细胞增殖旺盛，培养液由桃红色变成黄色时，需换液1次，吸弃旧培养液，加PBS液2mL清洗后吸弃，再加入新鲜培养液2～3mL，也可进行半量或2／3量换液。

2.4 细胞计数方法

使用计数板，上面盖上盖玻片，滴一滴细胞液，在显微镜下观察，在左上、左下、右上、右下各有四个小格，每个小格内有16个小格，分别计数，四个小格相加，除以4，后面加上（×104），再乘以稀释的倍数，就是估计的细胞数。

2.5 细胞鉴定（免疫组织化学染色）

将第3代对数生长期的细胞悬液接种到预先放置有盖玻片的六孔板中。待细胞基本长成单层后，取出盖玻片，PBS洗5min×3次。4%多聚甲醛室温下固定15min，PBS再次洗5min×3次。将已固定好的细胞玻片放入盖片染色缸。PBS振洗5min，取出吹干。滴加兔抗鼠Ⅷ因子抗体，置入湿盒内。37℃保温30min或4℃冰箱过夜。PBS洗5min×3次。滴加辣根过氧化物酶聚合物标记羊抗兔IgG工作液，37℃孵育30min。PBS洗5min×3次。蒸馏水冲洗1次，50%缓冲甘油封片，镜检。

3 结果

3.1 倒置显微镜观察

细胞培养48h后，可见大部分贴壁细胞连接形成网状，细胞密度较低。3～5d后，内皮细胞岛出现。继续进行培养，细胞岛增大，可分为密度较大的中央区和密度较小的边缘区。约7～9d后细胞融合成片。VEC呈单层镶嵌状排列，呈现“鹅卵石样”或“铺路石样”，出现接触抑制现象。

图1 倒置显微镜下观察第一代血管内皮细胞 100×

图2 倒置显微镜下观察第二代血管内皮细胞 100×

图3 倒置显微镜下观察第三代血管内皮细胞 100×

3.2 生长曲线的绘制

图4 小鼠血管内皮细胞生长曲线

3.3 免疫组化结果

图5 免疫组化染色 200×

4 讨论

小鼠血管内皮细胞的体外培养的条件较为苛刻，在培养过程中可能存在以下问题：

（1）内皮细胞的纯化。血管内层为内皮细胞，中层为平滑肌细胞，外层为成纤维细胞。成纤维细胞、平滑肌细胞与内皮细胞体外共同培养时具有生长优势，如果不在培养早期去除这些污染细胞，血管内皮细胞将不能增殖、传代。Zhao等［3］采用荧光激活细胞分类器（fluorescence－activated cell sorter，FACS）分离人脑血管细胞，效果良好。Favaro等采用免疫磁珠（immunomagnetic beads）进行人脑微血管内皮细胞的分离，效果良好。上述两种方法对实验器材要求较高且费用昂贵。Cheng等研究发现培养时内皮细胞和血细胞首先从组织块中游离出来，成纤维细胞和平滑肌细胞则会在培养72h后游离。原代培养60h后去除漂浮的细胞及组织植块，可保证剩余细胞大部分为内皮细胞和血细胞。传代培养1～2次后血细胞可以清除。

（2）培养液的选择。一般原代培养需要较高浓度的血清，而传代培养时血清浓度可以降低。研究显示，20%的胎牛血清对小鼠内皮细胞的原代培养有利，传代后的内皮细胞可以在含10%胎牛血清的RMPI1640培养液中生长。

（3）内皮细胞的鉴定。血管内皮细胞的鉴定常用的方法：免疫组织化学技术检测免疫标志物；倒置显微镜观察的

细胞形态特征和生长方式；RT－PCR（reverse trascriptase polymerase chain reaction）、流式细胞仪、蛋白组学检测内皮细胞表达的特异性蛋白质。

［1］ CARVALHO D，SAVAGE CO，ISENBERG D，et al.IgG anti－endothelial cell autoantibodies from patients with systemic lupus erythematosus or systemic vasculitis stimulate the release of two endothelial cell－derived mediators，which enhance adhesion molecule expression and leukocyte adhesion in an autocrine manner［J］.Arthritis Rheum，1999，42（4）：631－640.

［2］ CORTESINI R，SUCIU－FOCA N.ILT3＋ILT4＋tolerogenic endothelial cells in transplantation［J］.Transplantation，2006，82（1Suppl）：S30－32.

［3］ ZHAO Y，TAN YZ，ZHOU LF，et al.Morphological observation and in vitro angiogenes is assay of endothelial cells isolated from human cerebral cavernous malformations［J］.Stroke，2007，38（4）：1313－1319.