荣络健脑饮对脑缺血再灌注大鼠NGF、BDNF、bFGF表达的影响*

韩 宁 张 青 房位昊

（山东中医药大学附属医院，山东 济南 250011）

目前缺血性中风的西医治疗主要强调超早期溶栓和保护缺血后脑组织。溶栓的严格适应证使其应用受限，神经保护剂有广阔的应用前景，尤其是神经营养因子，但因其价格昂贵、难以透过血脑屏障，制约其应用与发展。中医药在神经保护方面发挥了独特的优势。本文通过建立脑缺血再灌注模型，从神经营养因子合成与释放角度探讨荣络健脑饮的神经保护机制，为中医药对中风的神经保护治疗提供依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物 130只健康SD大鼠，雌雄各半，体质量280～300 g，由山东中医药大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK（鲁）20050015。

1.2 药物与试剂 兔抗大鼠神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、碱性成纤维生长因子（bFGF）、多克隆抗体、SABC（兔IgG）、DAB显色剂等，以上试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。荣络健脑饮：人参12 g（单煎），鹿茸粉3 g（冲），龟甲 12 g（先煎），麦冬 30 g，菖蒲 15 g，川芎 20 g，赤芍 12 g，大黄 9 g，冰片 0.1 g（冲）。补阳还五汤：生黄芪 60 g，当归尾 12 g，赤芍12 g，川芎20 g，桃仁10 g，红花15 g，地龙 15 g。 上述药物购自山东中医药大学附属医院中药房。按常规方法制备，加水煎煮两次，每次1 h，合并煎液，分别浓缩成含生药1.0、1.3 g/mL的汤剂。

1.3 分组与造模 将大鼠用随机数字表法分为正常对照组、假手术组、模型组、补阳还五汤组、荣络健脑饮组5组，后4组又分为1、2、7 d 3个亚组，每个亚组10只大鼠。根据改良Longa法，建立大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）局灶性脑缺血模型。用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔麻醉大鼠，颈部备皮、消毒，沿颈部正中做一切口，分离皮下组织，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉，用动脉夹夹闭颈内动脉，距颈总动脉分叉处2 mm扎一小孔，插入栓线，松开动脉夹，插入深度距颈总动脉分叉约（18.5±0.5）mm处，遇阻力即停止进线，固定栓线并结扎，缝合皮下组织及皮肤。缺血1 h后，拔出栓线。参照Zea-Longa 5分制评分标准，于大鼠术后进行评分：0分，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向外侧转圈；3分，向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失；5分，死亡。神经功能缺损程度评分为1～3分的大鼠即为成功模型。假手术组：分离各个血管，然后缝合皮肤。模型组、补阳还五汤组、荣络健脑饮组：建立MCAO模型，缺血1 h再灌注1、2、7 d。

1.4 给药方法 正常对照组：日常饲料，自由饮水。其余各组于造模前4 d开始给药，模型组、假手术组灌胃生理盐水、补阳还五汤组灌胃补阳还五汤、荣络健脑饮组灌胃荣络健脑饮，剂量均为10 mL/kg，每日1次，直至处死。

1.5 标本采集与检测 10%中性甲醛灌注取脑，后将脑组织固定在甲醛溶液中。充分固定后，从视交叉后3 mm处取大脑中动脉供血区脑组织2 mm，行石蜡包埋，每一组织蜡块连续4 μm切片4张，1张行常规HE染色，3张分别行 NGF、BDNF、bFGF免疫组化染色。观察脑缺血1 h再灌注1、2、7 d后，对各组大鼠进行神经功能缺损程度评分。对免疫组化切片行计算机定量分析，测出NGF、BDNF、bFGF表达的平均灰度值。

1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。数据以（±s）表示，采用经q检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能缺损程度评分比较 见表1。各组大鼠神经功能缺损程度评分有随时间而变化的趋势，但时间因素的作用不随分组的不同而不同，而且总体而言各组有差异。每个时间点上各组比较，荣络健脑饮组大鼠神经功能缺损程度评分在不同时间点较模型组均明显改善（P＜0.05）。在脑缺血再灌注第2日、第7日，荣络健脑饮在改善大鼠神经功能缺损程度评分方面优于补阳还五汤（P＜0.05）。

表1 各组大鼠不同时间点神经功能缺损程度评分（分，±s）

表1 各组大鼠不同时间点神经功能缺损程度评分（分，±s）

与模型组比较，*P＜0.05；与补阳还五汤组比较，△P＜0.05。下同。

组 别 第2日 第7日正常对照组 - 0 n 第1日10 -假手术组 0 0 10 0模型组 10 2.83±0.41 2.50±0.55 1.83±0.41补阳还五汤组 10 2.33±0.52 1.83±0.41* 1.33±0.52*荣络健脑饮组 10 1.86±0.38* 1.14±0.38*△ 0.71±0.49*△

2.2 HE染色切片在光镜下观察结果 正常对照组和假手术组大鼠皮质、髓质未见明显病理改变。模型组可见较大的灶性水肿或软化灶形成，胞核变性、坏死，甚则细胞溶解、消失，并伴慢性炎性细胞浸润，或伴间质细胞增生，部分成纤维细胞增生、纤维化形成。补阳还五汤组和荣络健脑饮组与相应时间点的模型组比较病理改变程度较轻，其中以荣络健脑饮组最轻。

2.3 各组大鼠脑组织神经营养因子的表达 见表2～表4。与同时段的模型组、补阳还五汤组比较，荣络健脑饮组各神经营养因子的阳性表达均增强，差异有统计学意义。在脑缺血再灌注1、2、7 d不同的时间点补阳还五汤组大鼠脑组织NGF、BDNF的表达均增强，对bFGF的影响于缺血再灌注第2、7日显著，与模型组比较有显著差异（P＜0.05）。

表2 各组大鼠脑组织NGF表达平均灰度值比较（±s）

表2 各组大鼠脑组织NGF表达平均灰度值比较（±s）

组 别 第2日 第7日正常对照组 153.42±6.70 153.42±6.70 n 第1日10 153.42±6.70假手术组 159.08±5.59 157.14±7.15 10 153.90±8.54模型组 10 133.66±7.23 127.99±9.70 135.48±7.98补阳还五汤组 10 118.41±6.75* 113.53±3.77* 126.46±7.34*荣络健脑饮组 10 109.05±7.56*△ 104.87±8.14*△ 115.23±4.93*△

表3 各组大鼠脑组织BDNF表达平均灰度值比较（±s）

表3 各组大鼠脑组织BDNF表达平均灰度值比较（±s）

组 别 第2日 第7日正常对照组 163.42±6.41 163.42±6.41 n 第1日10 163.42±6.41假手术组 162.16±4.89 161.73±9.12 10 160.90±6.69模型组 10 121.66±10.37 135.31±7.08 138.30±7.05补阳还五汤组 10 112.41±6.49* 122.83±8.72* 132.53±8.75*荣络健脑饮组 10 103.05±6.37*△ 112.26±8.10*△ 119.79±7.13*△

表4 各组大鼠脑组织bFGF表达平均灰度值比较（±s）

表4 各组大鼠脑组织bFGF表达平均灰度值比较（±s）

组 别 第2日 第7日正常对照组 161.62±6.55 161.62±6.55 n 第1日10 161.62±6.55假手术组 158.62±5.29 155.48±8.14 10 159.69±6.30模型组 10 141.09±7.29 130.70±8.23 142.62±8.28补阳还五汤组 10 132.97±11.12 123.62±5.40* 130.02±4.88*荣络健脑饮组 10 121.50±8.56*△ 109.81±6.98*△ 120.64±6.00*△

3 讨 论

神经营养因子是一种调节神经系统发育、促进神经系统成熟、维持神经功能的蛋白质。其中发现最早的是NGF，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子。脑损伤时脑内源性NGF在皮层和海马区域的表达增加［1-2］，对神经元起保护作用。而且外源性NGF的应用可减少梗死体积并减轻脑水肿［3］。将鼠神经生长因子用于临床，发现其能有效减少患者的神经功能缺损程度评分，是一种有效治疗急性脑梗死的药物［4］。

BDNF是一种在神经元损伤后再生修复和防止神经细胞退行性变等多方面发挥重要作用的细胞因子［5］。脑缺血再灌注损伤可诱导BDNF极早表达，从多个方面抑制各种缺血再灌注损伤反应。如BDNF可诱导钙结合蛋白表达从而稳定细胞内Ca2+浓度［6］；下调N-甲基-D-天冬氨酸受体功能，以此拮抗兴奋性氨基酸的毒性［7］；抑制诱导型一氧化氮合酶的表达、胶质细胞的活性和巨噬细胞的浸润，自由基的生成［8］；通过调节Bax/Bcl表达抑制β-淀粉样蛋白诱导的细胞凋亡［9］等。

bFGF是FGF家族9个成员之一，不但能促进细胞增生分化和血管生成，还可明显减轻缺血性脑损伤［10］。MCAO后缺血侧几个脑区的bFGF mRNA与bFGF免疫反应增加［11］，bFGF表达后可通过调控HSP70蛋白和p53凋亡相关基因而发挥抗缺血性脑损伤的作用［12］。

笔者将内源性神经营养因子归属于中医“精”的范畴，并认为肝肾阴虚、气血衰少是致病之本，痰瘀阻络、脑髓失养是疾病难愈的主因。补肾益精、荣络活血，则可使脑髓充盈，元神功能正常，中风时出现的神昏、半身不遂、偏身麻木等症状得以恢复。据此，笔者拟定了具有益气填精、荣络活血功效的荣络健脑饮治疗中风。方中多味中药均可抵抗脑缺血再灌注损伤，且菖蒲、冰片引药入脑，促进其发挥神经保护作用。本研究结果表明荣络健脑饮可减轻脑缺血再灌注损伤造成的病理改变，降低脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损程度评分，促进脑组织NGF、BDNF、bFGF的表达，与补阳还五汤比较，有显著差异。促进脑组织NTF的表达是荣络健脑饮的神经保护机制之一。本研究从神经营养因子合成与释放角度，进一步阐释了扶正护脑法治疗缺血性中风的作用靶点，为中医药对中风的神经保护治疗提供了依据。

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